悪性細胞に特有の細胞基質間接着構造の分子構築と機能解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06281238
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 祖父江 憲治 大阪大学, 医学部, 教授 (20112047)
• 研究分担者: 林 健一郎 大阪大学, 医学部, 助手 (90238105) ; 乾 誠 大阪大学, 医学部, 助教授 (70223237)
• キーワード: 細胞骨格 / 動的接着部 / 辺縁接着部 / 収縮蛋白質 / カルデスモン / プロモーター解析

研究概要

ガン細胞あるいは悪性形質転換細胞における接着構造の機能とこれを構成するアクチン系細胞骨格の機能及び制御機能を明らかにすることは、がンの転移浸潤機構を理解するうえで重要である。本研究では、正常線維芽細胞とラウス肉腫ウイルスにより形質転換した細胞を比較することにより、形質転換細胞では運動性に富む動的接着部と静的な辺縁接着部の2種類の接着部位が形成されること、および動的接着部にはアクチン、ミオシン、カルデスモン(CaD)、トロポミオシンなどの収縮蛋白質が集積されることを見い出した。しかしながら、CaDは、正常細胞に比較して腫瘍細胞で発現量が著名に低下していた。この様な組織、細胞特異的なCaDの発現機構を解析するため、すでにクローニングずみのプロモーター領域をCAT遺伝子の上流に挿入したプラスミド及びこれ由来の一連の欠失変異プラスミドを構築した。これらのプラスミドを分化型形質を維持した平滑筋初代培養細胞及び脱分化型平滑筋細胞にトランスフェクションし、CATアッセイを行った。同様の解析をびHeLa細胞を用いておこなった。また、ゲルシフトアッセイによりDNAと核蛋白質の相互作用を解析した。その結果、CaDプロモーターは分化型平滑筋細胞において高い転写活性を示した。脱分化型平滑筋細胞では転写活性は抑制を受け前者の70〜40%程度であった。HeLa細胞での転写活性はさらに低く分化型平滑筋細胞における活性の10%以下であった。これらの結果はそれぞれの細胞でのCaD蛋白質の発現量と一致しており、CaDの組織特異的な発現は転写レベルで制御されていることが明らかになった。この分化型平滑筋細胞特異的な転写促進は転写開始部位の上流-309〜300に位置するCArGbox様配列(CCAAAAAAGG)に依存しており、この配列と前後6bpを含む配列CArG1と特異的に結合する核蛋白質が平滑筋細胞核抽出液中に存在することを見出した。以上の結果、このCArGbox様配列はCaDの平滑筋特異的な発現を制御している唯一のシス因子であることが明かになった。さらにガン細胞でCaD遺伝子のプロモーター解析を行い、転写制御の違いやガン細胞での転写抑制の要因を明らかにする必要がある。

研究成果

• [文献書誌] Yano,H.: "Identification of two distinct promoters in the chicken caldesmon gene." Biochemi.Biophys.Res.Commun.201. 618-626 (1994)
• [文献書誌] Tanaka,J.: "Localization and characterization of gelsolin in nervous tissues.Gelsolin is specifically enriched in myelin-forming cells." J.Neurosci.14. 1038-1052 (1994)
• [文献書誌] Watanabe,T.: "Annexin VI-binding proteins in brain.Interaction of annexin VI with amembrane skeletal proteins,calspectin(brain spectrin or fodrin)." J.Biol.Chem.269. 1756-17662 (1994)
• [文献書誌] Inui,M.: "Annexin VI binds to a synaptic vesicle protein,synapsin I." J.Neurochem.63. 1917-1923 (1994)
• [文献書誌] Kira,M.: "Caldesmon and low Mr isoform oftropomyosin are localized in neuronal growth cones." J.Neurosci.Res.(in press). (1995)
• [文献書誌] Yano,H.: "Transcriptional regulation of the chlcken caidesmon gene:activation ofgizzard type caldesmon promoter a CArGbox-like motif." J.Biol.Chem.(in press). (1995)
• [文献書誌] Nakamura,N.: "Differential localization of α2,αv,β2 and β5 integrins in human osteoclasts:their involvement in cell adhesion and bone resorption." J.Cell Sci.(in press). (1995)
• [文献書誌] Tanaka,J.: "Cell/substratum adhesion and movement of cultured rat astrocytes." Dev.Brain Res.(in press). (1995)
• [文献書誌] Yoshida,K.: "Reperfusion of rat heart after brief ischemia induces proteolysis of calspectin(non-erythroid spectrin or fodrin)by calpain." Circulation Res.(in press). (1995)
• [文献書誌] Ozawa,K: "Translocation of cortactin(p80/85)to the actin-based cytoskeleton during thrombin receptor-mediated platelet activation." J.Cell Sci.(in press). (1995)
• [文献書誌] Hayashi,K.: "Expressional regulation of caldesmon isoforms in assoceation with phenotypic modulation of smooth muscle cells." Japan Sci.Soc.Press, 159 (1995)