高親和性糖輸送担体の発現抑制による細胞増殖抑制作用に関する研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06282228
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 清野 裕 京都大学, 医学部, 助教授 (40030986)
• 研究分担者: 石田 均 京都大学, 医学部, 助手 (80212893)
• キーワード: GLUT1 / 転写調節 / ルシフェラーゼ・アッセイ / ゲルシフト・アッセイ / フット・プリント法 / HepG2

研究概要

我々はすでにヒトGLUT1遺伝子を単離し、転写開始部位および、5'-上流域の塩基配列を決定し報告した。さらに消化器癌や脳腫瘍でGLUT1の発現が著しく亢進し、癌細胞における細胞増殖に寄与する可能性を示した。本年度の研究において、この転写調節領域のDNA断片を制限酵素により処理し、数種類のdeletion mutantを作製してルシフェラーゼ発現プラスミドに組み込み、リン酸カルシウム法によりヒト肝癌細胞株HepG2に導入し、transient expressionの系でdeletionによる転写活性の変化を検討した。-317〜+181のDNA断片に対する5'-側からのdelectionでは、上流約200塩基を欠失させた-102〜+181のDNA断片までがきわめて強い転写活性を示し、さらに60塩基を欠失させた-40〜+181のDNA断片では活性が1/10まで低下し、このDNA断片から3'-側を欠失させた-40〜+55のDNA断片ではさらに活性が1/4となった。以上の知見より、ヒトGLUT1遺伝子の転写調節には転写開始点の上流-102塩基から下流+181塩基が特に重要であることが明らかとなった。引続き、培養したHepG2細胞より核抽出物を精製し、上記の-317〜+181のDNA断片を制限酵素処理して得た-312〜-168、-226〜-55、-102〜+74、-13〜+181の4種類のDNA断片を^<32>Pによって末端標識したプローブを用いてゲルシフト・アッセイを施工した。使用した4種類のプローブのいずれにも核蛋白が用量依存的に結合した。核蛋白の結合部位を特定するために行ったDNase Iフット・プリントでは、数カ所に核蛋白の結合によると考えられるラダーの変化が認められ、CCAAT配列、TATAA配列の他に、4カ所のTPA response element(TRE:TGACTACA)類似の配列を中心とする部分がDNase Iによる影響を受けにくくなっていた。先のdelection analysisの結果と合わせると、4か所のTRE類似配列のうち、-65付近と+60付近の配列がヒトGLUT1遺伝子の発現に深く関与していると予想されるため、今後、site directed mutagenesisなどの方法で変異を導入して転写活性の変化を検討する予定である。

研究成果

• [文献書誌] Y.Someya,et al.: "Two 3',5'-cyclic-adenosine monophosphate response elements in the promoter region of the human gastric inhibitory polypeptide gene." FEBS Lett. 317. 67-73 (1993)
• [文献書誌] A.Kubota,et al.: "Identification of somatostatin receptor subtypes and implication for the efficacy of somatostatin analog SMS 201-995 in treatment of human endocrine tumors." J Clin Invest. 93. 1321-1325 (1994)
• [文献書誌] H.Takagi,et al.: "Characterization of glucose transporter in cultured human retinal pigment epithelial cells:gene expression and effect of growth factors." Invest Ophthal Vis Sci. 35. 170-177 (1994)
• [文献書誌] T.Gonoi,et al.: "Functional neuronal ionotropic glutamate receptors are expressed in the non-neuronal cell line MIN6." J Biol Chem. 269. 16989-16992 (1994)
• [文献書誌] Q.Li,et al.: "A cloned rat CD38-homologous protein and its expression in pancreatic islets." Biochem Biophys Res Commun. 202. 629-636 (1994)
• [文献書誌] A.Kubota,et al.: "Multiple effect coupling of somatostation receptor subtype SSTR1." Biochem Biophys Res Commun. 204. 176-186 (1994)
• [文献書誌] Y.Someya,et al.: "In:Prevention and Treatment of NIDDM,Y.Goto,Y.H.Lee,T.Kaneko,Y.Shigeta(eds),Smith-Gordon,London" Effects of glucose concentration on GLUT1 and GLUT2 mRNA levels in rat pancreatic islets., 11-12 (1993)
• [文献書誌] K.Yasuda,et al.: "In:Insulin resistance in human disease,K.B.Huh et al.(eds),Elsevier,Amsterdam" Glucose transporter expression in diabetes., 21-24 (1993)