抗体を利用した生体内遺伝子ターゲッティング法の開発と癌遺伝子治療への応用

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06282257
• 研究機関: 慶応義塾大学
• 研究代表者: 清水 信義 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (50162706)
• 研究分担者: 高柳 淳 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80245464) ; 蒲生 忍 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (90122308)
• キーワード: 抗体 / 遺伝子治療 / イムノジーン / イムノポーター / EGFレセプター / エンドサイトーシス / 遺伝子導入 / ジフテリア毒素

研究概要

1.イムノジーンの作製
本研究で用いたモノクローナル抗体B4G7は、ヒトEGFレセプター(EGFR)を認識し、EGFRとともにエンドサイトーシスされる。チオエーテル結合で架橋した抗体/ポリリジン複合体「イムノポーター」は、ジスルフィド結合による複合体よりも安定で、高い遺伝子導入効率が得られた。また、イムノジーン法において、抗体・ポリリジン・DNAの量比を至適範囲に保つことが重要であった。
2.イムノジーンによる遺伝子導入
遺伝子導入効率の指標として、β-Gal遺伝子を運ぶイムノジーンを作製し、EGFRを過剰産生するA431細胞の培養液に添加した。5日以上にわたりX-gal染色される発現細胞数の上昇がみられた。またクロロキンで細胞を処理するとイムノジーン法による遺伝子導入効率が上昇した。さらに、毒性はないがエンドソームから細胞質への移行能は保持した変異型ジフテリア毒素を共存させて作製したイムノジーン・ジフテリア毒素複合体を用いると飛躍的な遺伝子導入効率の上昇が観察された。したがって、イムノジーンがエンドサイトーシス系を介し遺伝子を導入すること、また、リソソーム活性および細胞質への移行の制御が、遺伝子導入効率の上昇に重要であることが示唆された。
3.イムノジーンの癌治療への応用の試み
ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ(TK)遺伝子を発現するプラスミドを運ぶイムノジーンを作製し、EGFRを過剰産生する扁平上皮癌細胞(A431およびNA)培養に添加後、ガンシクロビルで処理した。イムノジーンを添加した細胞では、ガンシクロビル依存的な殺細胞効果が観察された。
本イムノジーン法は生体内の特定細胞へのターゲッティングが可能な遺伝子導入法で将来の遺伝子治療には不可欠の技術である。組織特異的なプロモーターの利用などとあわせて生体系での効果を評価するために担癌マウスでの実験を進めている。

研究成果

• [文献書誌] Chen,J.: "A novel gene delivery system using EGF receptor-mediated endocytosis." FEBS Lett.338. 167-169 (1994)
• [文献書誌] Aida,S.: "Distribution of epidermal growth factor and epidermal growth gactor receptor in human lung:Immunohistochemical and immunoelectron-microscopic studies." Respiration. 61. 161-166 (1994)
• [文献書誌] Gemon,S.: "Calphostin-C stimulates epidermal growth factor receptor phosphorylation and internalization via light-dependent mechanism." J.Cell.Physiol.158. 151-159 (1994)
• [文献書誌] Gamon,S.: "Light-dependent induction of early-response gene expression by calphostin-C." Cell Struct.Funct.19. 195-200 (1994)
• [文献書誌] Nishikimi,M.: "Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-gamma-lactone oxidase,the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man." J.Biol.Chem.269. 13685-13688 (1994)
• [文献書誌] Shimizu,N,: "Detection of epidermal growth factor receptor gene amplification in human aquamous cell carcinomas using fluorescence in situ hybridization." Jpn.J.Cancer Res.85. 567-571 (1994)
• [文献書誌] Wang,Y.: "The human genes for desmogleins (DSG1 and DSG3)are located in a small region on chromosome 18q12." Genomics. 20. 492-495 (1994)
• [文献書誌] Saga,M.: "Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa:A Mutation in Codon 181(Glu→Lys)of the Rhodopsin Gene in a Japanese Family." Ophthalmic Genet.15. 61-67 (1994)
• [文献書誌] Fujita,N.: "Genetic Origin Analysis of Hydatidiform Mole and Non-molar Abortion Using the Polymerase Chain Reaction Method." Acta Obstet.Gynecol.Scand.73. 719-725 (1994)
• [文献書誌] Tamai,S.: "Isolated Growth Hormone Deficiency Type 1A(IGHD-1A)without Apparent Growth Hormone(GH)-1 Gene Deletion." Clin.Pediat.Endocrinol.3. 105-111 (1994)
• [文献書誌] Gamou,S.: "Hydrogen peroxidepreferentially enhances the tyrosine phosphorylation of epidermal growth factor receptor." FEBS Lett.357. 161-164 (1995)
• [文献書誌] Minoshima,S.: "Mapping of the gene for human xanthine dehydrogenase(oxidase)(XDH)to band p23 of chromosome2." Cytogenet.Cell Genet.68. 52-53 (1995)