相同的組換えの中間体Holliday構造の移動と解離の分子機構

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06404002
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 品川 日出夫 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (40029799)
• 研究分担者: 岩崎 博史 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (60232659)
• キーワード: DNA組換え / DNA修復 / Holliday構造 / RuvCエンドヌクレアーゼ / RuvAタンパク質 / RuvBタンパク質 / ミュータント / RuvGタンパク質

研究概要

本年度は組換え中間体Holliday構造の分岐点移動をATP分解のエネルギーを利用して行わせるRuvABタンパク質複合体およびReeGタンパク質とHolliday構造を切断して解離するエンドヌクレアーゼRuvCの構造と機能の相関関係の解析を進め以下の成果を得た。
1.前年度に決定したRuvCのエンドヌクレアーゼ活性中心を形成する4個の酸性アミノ酸に関する研究を論文にまとめて発表した。
2.前年度単離した多数のruvCミュータントの産物タンパク質を精製し、二量体形成能、Holliday構造特異的結合能、特異的エンドヌクレアーゼ活性等を生化学的に解析し、RuvCタンパクのこれらの機能に関与するアミノ酸残基およびサブドメインについて研究した。
3.ruvA,ruvB両遺伝子のミュータントをPCRを用いて多数分離して、それらの表現型と突然変異部位を解析した。
4.RuvBタンパク質のATP結合モチーフ(GKT配列)を変化させるようなミュータントを部位特異的変異導入法で作成した。これらミュータントRuvBタンパク質を精製してATP結合能、ATP加水分解能、合成Holliday構造の分離する活性などを測定し、GKTモチーフがこれらの活性に重要な役割を果たしていることを証明した。
5.耐熱菌Thermus thermophilusのruvB遺伝子を単離して解析した。この菌においてはruvBの近辺にruvA,ruvC遺伝子が存在しなかった。
6.ReeGタンパク質がコリシンE1のDNA複製開始のRNAプライマーをそのRNAヘリカーゼ活性によって除去し、コリシンE1DNA合成を制御していることを発見した。

研究成果

• [文献書誌] Saito,A.,Iwasaki,H.,Ariyoshi,M.,Morikawa,K.,Shinagawa,H.: "ldentification of four acidic amino acids that constitute the catalytic center of the RuvC Holliday junction resolvase." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 92. 7470-7474 (1995)
• [文献書誌] Shinagawa,H.,Iwasaki,H.: "Molecular mechanisms of Holliday junction processing in Escherichia coli." Adv.Biophys.31. 49-65 (1995)
• [文献書誌] Shinagawa,H.,Iwasaki,H.: "Processing the Holliday junction in homologous recombination." Trends in Biochemical Sciences. (in press.). (1996)
• [文献書誌] 品川日出夫: "病気のバイオサイエンス(分担執筆:相同的遺伝子組換え機構)" 大阪大学出版会, 7 (1995)