| 研究課題/領域番号 |
06404042
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| 研究種目 |
一般研究(A)
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
前田 憲志 名古屋大学, 医学部, 教授 (90023853)
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| 研究分担者 |
宮田 敏男 名古屋大学, 医学部, 講師 (10222332)
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| キーワード | Advanced Glycation End Products:AGEs / 透析アミロイドーシス / β2ミクログロブリン / アマドリ構造 / AGEsレセプター / 抗AGEs抗体 |
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| 研究概要 |
透析アミロイドーシスは長期透析患者の重要な合併症である。最近、私たちは沈着アミロイドの主要成分であるβ_2ミクログロブリンの一部はメイラード反応により修飾を受け、茶色で蛍光を発するAdvanced glycation end products(AGEs)化している事実を明らかにした。本研究の目的は、透析アミロイドーシスの発症メカニズムを明らかにするため、AGEs化β_2ミクログロブリンの構造を解析し、さらに発症に重要な役割りを演ずる単球/マクロフア-ジ上のAGEsレセプターの構造と機能を解析することにあつた。
1.AGEs化β_2ミクログロブリンの構造
精製したAGEs化β_2ミクログロブリンのメイラード構造を〔^3H〕borotritideで標式し、EndoLys-Cで分析し、各ペプチドを逆相カラムを用いたHPLCで精製した。放射活性の取り込まれたペプチドを気相シークエンサで解析した結果、β_2ミクログロブリンにおける主要なメイラード反応部位はアミノ末端イソロイシンのαアミノ基であることがあきらかとなった。X線結晶解析像を解析することにより、31番目のヒスチジンのイミダゾール基がN末端イソロイシンにおけるアマドリ転移を強く触媒していることが示唆された。さらに上記ペプチドの分子量をFABマススペクトロメトリーにて解析することにより、AGEs化β_2ミクログロブリンに存在するアマドリ構造が同定された(N^α-(1-deoxyfructosyl)-isoleucine)。
2.AGEsレセプタ遺伝子のクローニング
正常人末梢血より単球分画のみを分取するため、私たちはFACSによるソーテイングを行った。このため予定の細胞数(約1×10^8)を集めたのに手間取ってしまい、本年はライブラリーの作製のみしかできなかった。
抗AGEs抗体の作製
AGEs化したKey hole limpet Hemocyanin(KLH)をウサギに免疫することにより、AGEs化BSA、AGEs化β_2ミクログロブリンに反応し、BSAやβ_2ミクログロブリン、KLHに反応しない抗体(ポリクロナル抗AGEs抗体)が作製できた。
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