骨芽細胞、軟骨細胞、筋肉の分化過程における骨形成因子(BMP)の役割の解析

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06404064
• 研究機関: 昭和大学
• 研究代表者: 吉木 周作 昭和大学, 歯学部, 教授 (30085740)
• 研究分担者: 高橋 直之 昭和大学, 歯学部, 助教授 (90119222) ; 須田 立雄 昭和大学, 歯学部, 教授 (90014034) ; 横瀬 敏志 昭和大学, 歯学部, 助手 (90245803) ; 池田 通 昭和大学, 歯学部, 講師 (00211029) ; 山口 朗 昭和大学, 歯学部, 助教授 (00142430)
• キーワード: 骨芽細胞 / 骨髄間質細胞 / 間葉系細胞 / 骨形成因子(BMP)

研究概要

骨芽細胞は軟骨細胞、筋肉、骨髄間質細胞(脂肪細胞を含む)などと共通の未分化な間葉系細胞に由来すると考えられている。これらの間葉系細胞の分化過程でTGF-bスーパーファミリーに属する骨形成因子(Bone morphogenetic proein)は骨芽細胞への分化を促進し、筋肉の分化を抑制することが報告されているが、骨髄間質細胞の分化に及ぼす作用は詳細に解析されていない。そこで、平成7年度は、2種類のクローン化された骨髄間質細胞株および初代培養にラット骨髄間質細胞の分化に及ぼすBMP-2の作用を検討した。
【材料と方法】(1)クローン化細胞株:マウス骨髄より樹立された前脂肪細胞株であるST2とMC3T3-G2/PA6(PA6)を用いた。両細胞は10%FBSを含むa-MEM培地で培養した。(2)初代骨髄間質細胞ぼ採取と培養:8週齢および2年齢のSDラットの骨髄をflashoutし、間質細胞を採取し、10%FBSを含むa-MEM培地で培養した。一部はcolony formation unit-fibroblastic (CFU-F)の動態を検索するために、低密度で培養した。
(3)Recombinant human BMP-2 (rhBMP-2)は山之内製薬株式会社から供与されたものを用いた。(4)骨芽細胞の表現形質を解析するために以下の項目を解析した。ALP活生の生化学的および組織化学的検出、副甲状腺ホルモン(PTH)応答性、オステオカルシン産生能。ALPおよびPTH受容体に関してはmRNAの発現をノーザンブロット法で解析した。
【結果】(1)BMP-2はST2およびPA6のALP活性を用量依存的に促進したが、その効果はST2の方がより顕著であった。(2)BMP-2はST2とPA6細胞のPTH依存性cAMP産生を誘導したが、その効果はST2細胞でより顕著であった。(3)BMP-2はST細胞のオステオカルシンの産生を誘導したが、PA6細胞はオステオカルシンの産生を誘導しなかった。(4)BMP-2はST2細胞のALPおよびオステオカルシンのmRNAの発現を誘導した。(5)ST2細胞をBMP-2と共にdiffusion chamber内に入れ、ヌードマウスの腹腔内に移植すると、chamberで骨形成が誘導された。(6)BMP-2はラット骨髄から採取した初代骨髄間質細胞のALP活性を促進した。また、BMP-2はALP陽性のCFU-Fの数を増加させた。この作用は2年齢の骨髄細胞でも認められた。
【考察および結論】骨髄の間質細胞はBMP-2の作用により骨形成能を有する骨芽細胞まで分化することとが明らかとなった。しかし、BMP-2に対する応答性がST2とPA6で異なったことより、骨髄間質細胞の骨面細胞への分化能には多様性があると考えられた。また、BMP-2は老齢ラットの初代骨髄間質細胞のALP活性を促進したことより、老齢ラットの骨髄間質細胞もBMP-2により骨芽細胞へ分化できることが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Yokose S, et al.: "An estrogen deficiency caused by ovariectomy increases plasma levels of systemic factors that stimulate proliferation and differentiation of osteoblasts in rats." Endocrinology. 137. 469-478 (1996)
• [文献書誌] Kotake S, et al.: "Interleukin-6 and soluble interleukin 6 receptors found in synovial fluids are responsible for inducing joint disruption in patients with rheumatoid arthritis." J. Bone Miner. Res.11. 88-95 (1996)
• [文献書誌] Iida K, et al.: "A possible role of vitamin D receptors in regulating vitamin D activation in the kidney." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92. 6112-6116 (1995)
• [文献書誌] Yamaguchi A, et al.: "Effects of BMP-2, -4 and -6 on osteoblastic differentiation of bone marrow derived stromal cell lines, ST2 and MC3T3-G2/PA6." Biochem. Biophys. Res. Commun.(in press).
• [文献書誌] Ikeda T, et al.: "Cloning of rat type lreceptor mRNA for BMP-2 and BMP-4 and comparison of the mRNA ocalization of its ligand." Dev. Dynamics (in press).
• [文献書誌] Ikeda T, et al.: "Changes in biological activity of bone cells in ovariectomized rats revealed by in situ hybridization" J. Bone Miner. Res. (in press).