シビレエイ電気器官シナプスを用いた神経伝達物質遊離機構とその調節機構に関する研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06404076
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 桐野 豊 東京大学, 薬学部, 教授 (10012668)
• 研究分担者: 得丸 博史 東京大学, 薬学部, 助手 (70262160) ; 川原 茂敬 東京大学, 薬学部, 助手 (10204752)
• キーワード: シビレエイ電気器官 / シナプトソーム / カルシウムチャネル / アセチルコリン / 抗体カラムクロマトグラフィー

研究概要

I.シビレエイ電気器官神経終末形質膜のCaチャネルの同定
(1)薬理学的研究により、シビレエイ電気器官シナプトソームからのアセチルコリン(ACh)遊離に関与する電位感受性Caチャネルには、ω-CgTX及びω-conotoxin-MVIIC感受性(N型様)、ω-Aga-IVA感受性(P型様)、カルシセプチン感受性(L型様)の3種類が存在すること判明した。このうち、N型様とP型様の寄与が大きい。
(2)シビレエイ電気器官神経終末のCaチャネルに対する上記薬物の結合親和性は低いので、これら薬物の結合を指標としたCaチャネルの同定・精製を行うことは困難である。そこで、哺乳類Caチャネル抗体を利用する試みを行った。(1)哺乳類のN型及びL型Caチャネルα_1サブユニットのアミノ酸配列の共通部に対する抗ペプチド抗体を用いたウエスタンブロット解析により、150kDaのCaチャネルα_1サブユニット(N型或はL型)を同定した。(2)哺乳類L型Caチャネルα_2δサブユニットに特異的なモノクローン抗体MCC-1は、シナプトソームからのACh遊離を部分的に阻害した。この阻害は、抗体の用量依存的であり、最大阻害が25%であった。MCC-1による阻害が、ω-CgTXの効果と相加的であること、そしてMCC-1が^<125>I-ω-CgTX架橋後のCHAPS Extractから放射能を免疫沈降しないことから、MCC-1の認識するCaチャネルはL型チャネルと考えられる。このMCC-1結合分画には、抗体によって直接認識される170kDaポリペプチド(α_2δサブユニット)の他、シンタキシン(35kDa)が含まれていた。
(3)電気器官シナプトソームをATP,AMP,Adenosineで処理すると、ACh遊離がこれらの濃度に依存して抑制された。AChとともに遊離されるATPは前膜に存在するEcto-ATPaseやEcto-ADPaseなどによってADP,AMP,Adenosineの順に速やかに変換される。神経終末には、これらのヌクレオシド及びヌクレオチドに対するautoreceptorが存在し、自己抑制的にAChの遊離量を調節していると考えられる。ω-CgTXとATPによる抑制効果は相加的でなく、autoreceptorによる遊離抑制作用は、N型チャネルを介したCa流入の抑制の結果として起こるという推測を支持する。
II.シビレエイ電気器官神経終末シナプス小胞膜蛋白質の同定
(4)凍結電気器官より高純度のコリン作動性シナプス小胞を調製した。伝達物質遊離に関与するタンパク質の存在を、哺乳類シナプス小胞タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロット解析により調べたところ、シナプトフィジン(45kDa)、シナプトタグミン(60kDa)及びSNAP-25(30kDa)が同定できた。

研究成果

• [文献書誌] K.Shinozaki,K.Anzai,Y.Kirino,S.Lee,H.Aoyagi: "Ion Channel Activity of a Synthetic Peptide with a Primary Structure Corresponding to the Presumed Pore-Forming Region of the Vo1tage-Dependent Potassium Channel" Biochem.Biophys.Res.Commun.198. 445-450 (1994)
• [文献書誌] K.Shinozaki,K.Anzai,Y.Kirino,O.Oishi,S.Lee,H.Aoyagi: "Synthesis and Property of H5 Region-Related Peptide of K^+ Channel and Its Ion Channel-Forming Ability" Peptide Chemistry 1993(Y.Okada,Ed),Protein Research Foundation. 365-368 (1994)
• [文献書誌] T.Iwata,S.Lee,O.Oishi,H.Aoyagi,M.Ohno,K.Anzai,Y.Kirino,G.Sugihara: "Design and Synthesis of Amphipathic 3_<10>-Helical Peptides and Their Interactions with Phospholipid Bilayers and Ion Channel Formation" J.Biol.Chem.269. 4928-4933 (1994)
• [文献書誌] K.Anzai,C.Takano,K.Tanaka,Y.Kirino: "Asymmetrical Lipid Charge changes the Substate Conductance of the Potassium Channel from sarcoplasmic Reticulum" Biochem.Biophys.Res.Commun.199. 1081-1087 (1994)
• [文献書誌] S.Lee,T.Tanaka,K.Anzai,Y.Kirino,H,Aoyagi,G,Sugihara: "Two Mode Ion Channels Induced by Interaction of Acidic Amphi pathic α-Helical Peptides with Lipid Bilayers" Biochem.Biophys.Acta.1191. 181-189 (1994)
• [文献書誌] K.Anzai,Y.Kirino: "Rapid Measurement of Internal Volumes of Membrane Vesicles with ESR-Stopped Flow Technique" Proceedings of International Conference on Bioradicals Detected by ESR Spectroscopy. June 12-16 (1994)
• [文献書誌] M.Inoue,H.Utsumi,Y.Kirino: "A Comparative ESR Study of Some Paramagnetic Metarials as a Probe for Non-Ivasive Measurement of Dissolved Oxygen Concentration in Biological Systems" Chem.Pharm.Bull.42. 2346-2348 (1994)
• [文献書誌] A.Kusumoto.K.Umeoka,S.Toda,N.Hirashma,Y.Kirino: "Simultaneous Measurement of Changes in Intracellular Calcium Ions and Degranulation in Single Intact Mast Cells from Rat Peritoneum" Bioimages. (in press). (1995)
• [文献書誌] H.Tokumaru,S.Shojaku,H.Takehara,N.Hirashima,H.Saisu T.Abe,Y.Kirino: "Calcium Channel of Presynaptic Nerve Terminal Membranes from the Electric Organ of Narke japonica Contains a Non-N-type α_2δ Subunit" J.Neurochem.(in press). (1995)