| 研究課題/領域番号 |
06453128
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
有機工業化学
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
山田 秀徳 岡山大学, 工学部, 教授 (80037613)
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| 研究分担者 |
小坂 恵 岡山大学, 工学部, 教務員 (00170233)
妹尾 昌治 岡山大学, 工学部, 助教授 (90243493)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1995
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| キーワード | チオール保護試薬 / 変性タンパク質の溶解度 / インクルージョンボディ / タンパク質工学 |
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| 研究概要 |
大腸菌にシステイン残基を有する外来性タンパク質を生産させるシステムの有用性を高めるために、変性タンパク質を変性剤なしに可溶化できる電荷を有するSH基の新しい保護試薬を合成し、タンパク質工学への応用を試みた。まず、変性タンパク質の溶解度と総電荷及び疎水性との関係を調べるために、ジスルフィド結合を還元した4種のタンパク質のSH基を電荷を持つアルキル化試薬で修飾した。その結果、変性タンパク質は、その総電荷が疎水性残基1個当り+0.17以上または-0.32以下であれば、1mg/ml以上の溶解度を示すことがわかった。次に反応を可逆的にするためにSH基と速やかに混合ジスルフィド結合を形成し、かつ電荷が導入できるメタンチオスルホネート誘導体を種々合成した。これらの試薬を還元タンパク質のSH基と反応させた結果、塩基性タンパク質には正電荷を、酸性タンパク質には負電荷を導入すると、予想通りこれらの修飾タンパク質は変性状態でも水によく溶けた。また本法で導入したジスルフィド結合はプロテアーゼ消化の条件では安定であったが、還元により元のSH基に戻すことができた。さらに大腸菌に不溶性のインクルージョンボディとして生産させたが、従来の方法では菌体から抽出ができなかったヒトリボヌクレアーゼ4及び分泌型ヒト線維芽細胞成長因子受容体を還元後、正電荷を有するトリメチルアンモニオプロピルメタンチオスルホネート(TAPS-スルホネート)でSH基を修飾(保護)したところ、容易に可溶化され、精製することができた。本法で精製したヒトリボヌクレアーゼ4はグルタチオンの酸化・還元系で活性構造に巻き戻った。したがって、大腸菌にインクルージョンボディとして生産させたジスルフィド結合を持つ外来性タンパク質の抽出、N末端プロセッシング、巻き戻しにTAPS-スルホネートは極めて有用であると結論される。
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