高分解能のX線回折を示すチトリロム酸化酵素とチトリロムbC_1複合体の結晶の作製

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06453220
• 研究機関: 姫路工業大学
• 研究代表者: 吉川 信也 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40068119)
• キーワード: チトクロム酸化酵素 / チトクロムbc_1複合体 / 膜タンパク質 / 結晶化 / X線結晶構造解析 / 界面活性剤

研究概要

チトクロム酸化酵素
結晶化に及ぼす界面活性剤の構造の効果を組織的に検討した。アルキルポリオキシエチレン型界面活性剤のオキシエチレン鎖長は結晶化条件に大きく影響し、長さによって六方両錘状、四角板状、四角柱状の三つの型の結晶が得られた。しかし、飽和炭化水素鎖長は臨界ミセル濃度に大きく影響するが結晶化条件には全く影響がなく、同じ結晶がほとんど同一の条件で得られた。一方、糖アルキル型界面活性剤を用いたときは結晶化条件に及ぼす界面活性剤の構造の影響はずっと大きく、デシルマルトシドで得られた結晶がドデシルマルトシドを用いると結晶の完全性が著しく低下したし、デシルシュークローズでは結晶さえ得られなかった。ただ、デシルマルトシドで安定化した標品の結晶の完全性はアルキルポリオキシエチレンのそれよりはるかに高く、一部の回折点は2.8Å分解能でさえ認められた。このような結晶化条件に対する高い構造要求性は界面活性剤の親水性部分の構造のかたさによるものと考えられる。したがって、界面活性剤は結晶の安定化に寄与する相互作用に直接関与していないとこれまで考えられてきたが、これらの結果は、結合した界面活性剤間にも特異的な接触があり、それが結晶の完全性を高める要因となっていることを示唆している。
チトクロムbc_1複合体
結晶化条件に及ぼす界面活性剤の構造の効果を検討し、デシルシュークロースにより、四角両錘型の新しい結晶を得た。この結晶化は結晶の可溶化の際のタンパク質濃度に敏感で20mg/mlで可溶化すれば析出するが、25mg/mlでは析出しなかった。この結晶は格子定数もこれまでに得られているものよりずっと小さく、実験室の回折装置でも測定可能出あるため、重原子誘導体調製のスクリーニングにも便利である。しかし、X線回折の分解能はまだ6Å程度でありさらに結晶化条件の最適化が必要である。

研究成果

• [文献書誌] S.Yoshikawa: "Effects of overall oxidatio state on infrared spectra of Heme a_3 cyanide in bovine heart cytochrome c oxidase" J.Biol.Chem.270. 4270-4279 (1995)
• [文献書誌] K.Shinzawa-Itoh: "Effects of ethy leneglycol chain length of dodecyl polyethyleneglycol monoether on the crystallization of bovine heart cytochrome c oxidase" J.Mol.Biol.246. 572-575 (1995)
• [文献書誌] D.A.Proshlyakov: "Selective resonance Raman observation of the “607 nm"form generated in the reaction of oxidized cytochrome c oxidase with hydrogen peroxide" J.Biol.Chem.269. 29385-29388 (1994)
• [文献書誌] S.Hirota: "Observation of a new oxygen-isotope-sensitive Raman band for oxyhemoproteins and its implications in heme pocket structure" J.Am.Chem.Soc.116. 10564-10570 (1994)
• [文献書誌] M.Kawamoto: "New crystal forms and preliminary X-ray deffraction studies of mitochondrial cytochrome bc_1 complex from bovine heart" J.Mol.Biol.244. 238-241 (1994)
• [文献書誌] S.Hirota: "Vibrational assignments of the FeCO unit of CO-bound heme proteins revisited:observation of a new CO-isotope-sensitive raman band assignable to the FeCO bending fundamental" J.Phys.Chem.98. 6652-6660 (1994)