| 研究概要 |
昆虫の外骨格が傷を受け、その場所にバクテリアが存在すると傷害部位のしたにある表皮細胞が抗菌ペプチドを合成することを我々は既に報告している(Brey et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 6275-6279)。また、我々は昆虫のクチクルにも血液と同じようなフェノールオキシダーゼ前駆体カスケードが存在すること観察している(Ashida and Brey. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 10698-10702)。このように昆虫のクチクルは生態防御に重要な役割を担っていいると考えられているメカニズムを備えている。このクチクルの生体防御機構をよりよく理解するために本年度はクチクルのフェノールオキシダーゼ前駆体(proPO)カスケード構成要素の内、特にフェノールオキシダーゼ前駆体活性化酵素(PPAE)前駆体(proPPAE)のcDNAクローニングとクチクルフェノールオキシダーゼ前駆体が何処で合成されるかについて研究を行った。
ProPPAEのcDNAはクチクルから精製されたPPAEの部分アミノ酸配列をもとにDNAプローブを合成し、そのプローブを用いて表皮細胞のcDNAライブラリーからPCR法によりproPPAEのcDNAを合成した。このcDNAをpBluescript SK (-)ベクターにクローニングし、その塩基配列を決定した。ProPPAEは一本鎖のポリペプチドとして合成され、リジンのカルボキシル基側のペプチド結合が加水分解されることにより活性化されることが明らかとなった。
ProPOのmRNAはノーザンブロット解析で表皮細胞に検出できなかったので表皮細胞以外の組織で合成されクチクルに運ばれていると考えられている。これを証明するためにproPOのイソフォームを血液から二種類精製し、一つのイソフォームしか持たないカイコにそのカイコの持っていないイソフォームを注射してそのイソフォームの血液からクチクルへの移行を実証する実験の準備を行った。二つのイソフォームを均一にまで精製する方法を確立することが出来た。
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