遺伝子ノックアウト→レスキューの戦略によるシオン軽鎖キナーゼの生理機能の解析

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06454156
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 小浜 一弘 群馬大学, 医学部, 教授 (30101116)
• 研究分担者: 石川 良樹 群馬大学, 医学部, 助手 (20212863) ; 岡垣 壮 群馬大学, 医学部, 講師 (80185412)
• キーワード: 平滑筋 / ミオシン軽鎖キナーゼ / カルシウムイオン / アンチセンス / 収縮制御 / 制御蛋白質 / りん酸化

研究概要

平滑筋の収縮がCa^<2+>より制御されていることに関しては、現在、まず異論はないと考えられている。この制御に関しては、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)によるミオシン軽鎖のリン酸化を介しているとのリン酸化説が主流的である。しかし最近の先端技術のとれ入れにより生理・薬理学的知識は増大し、この明快なミオシン連関制御のみでは説明できなくなって来た。私どもは、後者が次のようにアクチンに連関した強力な制御作用のあることを明らかにした。
i)アクチンと結合して、アクトミオシン系に抑制作用をかけること。
ii)この作用はCa^<2+>存在下のカルモジュリンで解除されること。
しかし、実際にどの様に平滑筋細胞内(in vitro)で機能しているか不明の点が多い。
本研究では、i)MLCKのcDNAを利用して大腸菌内でアクチン結合部位を合成させ機能部位を決定することであるが、pET発現ベクター系を用い種々の長さのMLCKを得て、N末端の41残基に機能部位の局在することをつきとめた。次に、ii)平滑筋細胞でMLCKのアンチセンスcDNAを利用してMLCKをノックアウトすることであるが、レトロウイスルpCXLp-プラスミドを平滑筋株SM-3にトランスフェクトさせ、stable transformantを得た。この細胞ではMLCKの発現レベルが下っていた。現在、この細胞の機能を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Sato, M.: "Myosin light chain kinase from vascular smooth muscle inhibits the ATP-dependent interaction between actin and myosin by binding to actin" J. Biochem.118. 1-3 (1995)
• [文献書誌] Hayakawa, K.: "Reversible effects of Okadaic acid and Microcyotin-LR on the ATP-dependent interaction between actin and myosin." J. Biochem.117. 509-514 (1995)
• [文献書誌] Higashi-Fujime, S.: "The fastest actin-based motor protein from the green alga, Chara, and its distinct mode of interaction with actin." FEBS Lett.375. 151-154 (1995)
• [文献書誌] Ishikawa, R.: "Purification of an ATP-dependent actin-binding protein from a lower eukaryote, Physarum polycepharum." Biochem. Biophys. Res. Commun.212. 347-352 (1995)
• [文献書誌] Kohama, K.: "Smooth muscle contraction. New regulatory modes." Japan Sci. Soc. Press & S. Karger, 159 (1995)
• [文献書誌] Maruyama, K.: "Calcium as cell signal" Igaku-Shoin, 293 (1995)