心筋細胞内プロテインキナーゼCとカルシウムのクロストーク:細胞内分布の可視化

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06454291
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 木原 康樹 京都大学, 医学部, 助手 (40214853)
• キーワード: 心筋細胞 / 細胞内カルシウム / プロテインキナーゼC

研究概要

共焦点レーザースキャン顕微鏡下における、単離心筋細胞内Ca^<2+>濃度分布とPKC活性分布との同時測定系の開発を計画しその可能性を検討した。
1)哺乳類成熟心室筋細胞の単離:雄Wistarラット(200-250g)より麻酔開胸下に心臓を摘出し、ランゲルドルフ冠灌流下にコラゲネース法を用い左室心筋細胞を単離した。単離法による細胞膜障害の影響を検討するため、一部は細胞培養メディア(glutamine-free medium 199^+cytosine-α-D-arabinofuranoside)に移し、24時間、37℃にて保存し、単離直後に使用した細胞における結果と比較したが基本的差異は認められなかった。
2)細胞内Ca^<2+>蛍光指標Indo-1の負荷とCa^<2+>測定:単離した心筋細胞をフィブリンでコートした0.12mm厚のカバーグラスに散布(〜500+/25mm径)し、BSAを含まないTyrode溶液にて表在灌流した(37℃)。Inod-1は10μMacetoxymetyl ester (AM)型として10分間灌流し、その後はTyrode液にて30分間洗浄した。カ-ルツァイス社LSM410倒立型共焦点レーザースキャン顕微鏡を用い、argoneレーザー光を360±5nmのフィルターを通して光源とし、蛍光は405±10nm及び485±10nmにて同期フィルターを用いて検出した。Ca^<2+>濃度は|Ca^<2+>|=Kd(F-F_<min>)/(F_<max>-F),Kd=250nmによりin vivo校正で推定を試み一応妥当なレベルが得られたが、ミトコンドリア等への色素の分布が明らかに認められ、その精度については更なる検討が必要と考えられた。

研究成果

• [文献書誌] Kihara Y.,et al: "L-Methionine angments myocardial contraction by sensitizing uyofilament for calcium." Circ.Res.(in press). (1995)
• [文献書誌] Morii I.,et al: "Mechanisms of negative force-fr-equency relationship in the physiolog-ically intact rat ventricular inyocardium." Jap.Ciec.J.(in press). (1995)
• [文献書誌] Inoko M.,et al: "Neurohumoral factors during transition from leffventricular hypertrop-hy to failure in Dahl salt-sensitive rats." Biochem-Biophys.Res.Comneun.206. 814-820 (1995)
• [文献書誌] Inoko M.,et al: "Transition from conpensatory hypertrophy to dilated,failing leffventricles in Dahl salt-sensitive rats." Am.J.Physiol.267. H2471-H2482 (1994)
• [文献書誌] Sasayama S.et al: "Clinical effects of long-term administration of pimoben an in patients with moderate congestive heart failure." Heart and Vessels. 9. 113-120 (1994)
• [文献書誌] Kihara Y.,et al: "Sodium/calcium exchange modulates intracellular calcium overload duri-ng posthypoxic reoxygenation in mami-nalian working myocardium." J.Clin.Invest.93. 1275-1284 (1994)
• [文献書誌] Grossman W.and Lorell B.H.: "Diastolic relaxation of the hea-rt" Kluwer Academic Publishers,Bos-ton, 430 (1994)
• [文献書誌] Sasayama S.: "Recent insights into failing he-art syndrome" Spiinger-Verlog Tokyo,Inc.(in press), (1995)