| 研究概要 |
本研究の目的は切歯あるいは歯胚器官培養を用いて,TGF-β1および細胞外マトリックスの遺伝子発現と蛋白の局在を観察し,歯の形式でTGF-β1が細胞外マトリックスの合成および分泌をどのように制御するものかを解明することである。
1.材料:(1)臼歯における観察:マウス切歯,胎生期13,から生後7日のDDYマウス臼歯歯胚を用い,パラフィン切片とした。
(2)器官培養:マウス胎生期18日の第1臼歯歯胚をBGLb培地で2,4,7日間培養した。またサイトカイン(TGF-β1,IL-1,EGF)存在下でも培養を行った。培養後パラフィン切片とした。
2.in situ Hybidization
【mRNAのprobeの作製法】
probeはTGF-β1:マウスTGF-β1,ウシamelogenin,マウスtype I collagenおよびヒトosteonectinをtemplateとして用いた。[α-^<35>S]UTP存在下でRNA probeを作製し,hybridizationを行った。
3.免疫組織化学:抗体はヒトTGF-β1,ウシamelogenin,抗ラット抗体などを用い,ABC反応を行った。
【結果】
切歯,臼歯および一般培養ではエナメル器では,TGF-β1およびamelogeninによる遺伝子発現は前および分泌期エナメル芽細胞に強く発現された。また歯乳頭においては,TGF-β1,type I collagen,osteonectinによる遺伝子発現は前および分泌期象牙芽細胞に強く発現された。
一般培養では,培養2日後では硬組織形成は認められなかった。培養4日後では歯乳頭細胞の一部は象牙芽細胞に分化し,歯乳頭側に象牙質が形成された。また培養7日にエナメル質が形成される像が観察された。
TGF-β1存在下で培養を行ったものでは硬組織形成は一般培養よりも早い時期に開始され,type I collagen,osteonectinの遺伝子発現は培養後2日,amelogeninでは4日後に発現が見られ,一般培養のものに比べ早い時期に遺伝子発現が観察された。
またIL-1およびEGF存在下での培養ではtype I collagen,osteonectinによる遺伝子発現に変化は見られなかった。この実験結果からTGF-βは歯の硬組織を形成する細胞の分化および細胞外マトリックスの合成を制御することが証明された。
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