| 研究概要 |
1。まず、新規軟骨分化関連遺伝子のクローニングと機能解析のための細胞培養系の特徴を把握するためヒト軟骨細胞様細胞株(HCS)の性状解析とウサギ肋軟骨in vitro増殖・分化系の詳細な解析をおこなった。
2。ついで、これらの軟骨系の細胞と骨芽細胞系の細胞との間に,differential display法を適用し、7個の未知遺伝子と数個の既知遺伝子と相同性を有する遺伝子を得た。その内、今まで軟骨細胞での報告がなかったヒト結合組織増殖因子(human connective tissue growth factor ; CTGF)と相同性を有するヒト軟骨肉腫細胞株HCS由来の遺伝子のcDNAのクローニングを行った結果,この遺伝子hcs24はCTGF蛋白をコードしており,ctgfと同一の染色体DNAに由来することが判明した。その発現は培養細胞ではHCS-2/8細胞とウサギ肋軟骨成長軟骨細胞に特に強く、上記ウサギ肋軟骨成長軟骨細胞in vitro増殖・分化系では肥大化期に最大となった。また、HCS-2/8細胞における発現は内軟骨性骨形成に重要な役割を果たすTGF-βやBMP-2により著明な誘導を受けた。
3。17日齢マウス胎仔のin situハイブリダイゼーションの結果そのmRNAの発現は軟骨細胞特に肥大軟骨細胞に強かった。
4。抗PDGF抗体がCTGFを認識することを利用し、ウエスタンブロットでHCS-2/8細胞CTGF蛋白を産生していること確認した。
5。アンチセンスDNAをHCS-2/8細胞in vitro増殖・分化系に添加するとそのプロテオグリカン合成が増加し、一方、その増殖は著明に抑制された。さらに、ウサギ成長軟骨細胞増殖・分化系ではアルカリホスファターゼ活性を増加させた。したがって、ctgf/hcs24の遺伝子産物すなわちCTGFは増殖期の軟骨細胞が分化、成熟するのを抑え、一方、その増殖を促進する作用を有することが判明した。
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