ヒト胎児に特異的に発現するチトクロームP450:発現調節機構とトランスジェニックマウスを用いた機能解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06454593
• 研究種目: 一般研究(B)
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 鎌滝 哲也 北海道大学, 薬学部, 教授 (00009177)
• 研究分担者: 佐久間 勉 北海道大学, 薬学部, 助手 (30250468) ; 横井 毅 北海道大学, 薬学部, 助教授 (70135226)
• キーワード: チトクロームP450 / 発現調節 / バキュロウイルス発現系 / 大量発現系 / トランスジェニックマウス / 胎児特異的

研究概要

1.胎児や成人に発現するチトクロームP450(CYP)の発現調節機構
胎児の肝臓に特異的に発現しているCYP3A7と成人で特異的に発現しているCYP3A4遺伝子の5′-上流領域の塩基配列を比較したところ、91%という高い相同性を示した。一方、高い相同性を有しながらも、それぞれに特異的な挿入配列NFSEおよびHFLaSEが存在することを見い出した。ゲルシフトアッセイによりこれらの配列に結合する因子を解析したところ、胎児および成人の肝核抽出液中に結合する因子が存在した。また、CYP3A4遺伝子の-445から-254の領域に転写活性化領域が存在することを明らかにした。
2.バキュロウイルスを用いた発現系の構築
CYP3A7のcDNAを組み込んだ組み換えバキュロウイルスを作製し、昆虫細胞株Sf9およびHigh Five細胞に感染させた。その結果、両細胞でP450蛋白質の発現に成功した。CO差スペクトル解析およびイムノブロット分析の結果より、目的のP450蛋白質が発現していることが確認された。現在、発現させた蛋白質の酵素活性について検討中である。
3.トランスジェニックマウスの作出
CYP3A7 cDNAを導入したトランスジェニックマウスを作出し、CYP3A7の発現を検討した。その結果、肝臓でCYP3A7 mRNAが発現しているものを初めとして、各組織での発現のパターンが異なる7系統を確認した。

研究成果

• [文献書誌] H.Hashimoto et al.: "Fetus-specific CYP3A7 and abult-specific CYP3A4 expressed in Chinese hamster CHL cells have similar capacity to activate carcinogenic mycotoxins." Cancer Res.55. 787-791 (1994)
• [文献書誌] T.Yanagimoto et al.: "Molecular cloning and functional expression of a mouse cytochrome P450(Cyp3a-13):Examination of Cyp3a-13 enzyme to activate aflatoxin B_1(AFB_1)." Biochim.Biophys.Acta. 1201. 405-410 (1994)
• [文献書誌] Y.Yanagawa et al.: "Stable expression of human CYP1A2 and N-acetyl-transferase:Mutagenic activation of 2-amino-3-methylimidazo〔4,5-f〕quinoline (IQ)and 2-amino-3,8-dimethylimidazo〔4,5-f〕quinoxaline(MeIQx)." Cancer Res.54. 3422-3427 (1994)
• [文献書誌] S.Itoh et al.: "A novel form of mouse cytochrome P450 3A(Cyp 3a-16):Its cDNA cloning and expression in fetal liver." Eur.J.Biochem.226. 877-882 (1994)
• [文献書誌] T.Sakuma et al.: "Efficient complementary DNA directed expression of human fetal liver cytochrome P450(CYP3A7)in insect cells using baculovirus." Biochem.Mol.Biol.Intern.(in press). (1995)
• [文献書誌] M.Kitada and T.Kamataki: "Cytochrome P450 in human fetal liver:Significance and fetal-specific expression." Drug Metab.Rev.26. 305-323 (1994)
• [文献書誌] T.Kamataki et al.: "Characters of house musk shrew(Suncus Murinus):Focusing on enzymes involved in drug metabolism.in "Proc.of ROC-Japan Symposium on Suncus Murinus:New Experimental animal,its speciality and Usefulness"" Ed.by Chau-Yang Chen Chia Nan Junior College of Pharmacy Press, (1994)