尿素サイクル異常症の遺伝子治療に関する研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06454610
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 松田 一郎 熊本大学, 医学部, 教授 (10000986)
• 研究分担者: 斎藤 泉 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (70158913) ; 犬童 康弘 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (40244131) ; 遠藤 文夫 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (00176801)
• キーワード: OTC欠損症 / 遺伝子治療 / アデノウイルスベクター / CAGプロモーター / spf^<ash>マウス

研究概要

CAGあるいはSRαプロモーターによって発現するヒトOTC遺伝子を含む、2種類の非増殖性組換えアデノウイルスベウタ-(AdexCAGhOTCおよびAdexSRαhOTC)を作製し、OTC欠損疾患者の初代培養肝細胞ほか数種の培養細胞で発現実験を行った。検討した全ての細胞において、AdexCAGhOTCは、AdexSRαhOTCに比較して高い発現を示した。
さらにウイルス液の濃縮精製を行い、OTC欠損症のモデルマウスであるspf^<ash>マウスを用いたin vivoでの遺伝子導入を試みた。塩化セシウム勾配法での濃縮により、AdexCAGhOTCでは3×10^9PFU/ml、AdexSRαhOTCでは2×10^9PFU/mlの力価が得られた。この高力価ウイルス液をspf^<ash>マウスに尾静脈から投与し、肝でのOTC活性および蛋白の発現と尿中オロット酸の変化を調べた。その結果、
(1)3.5×10^9PFUのウイルスを投与したマウスは死亡し、肝組織では広汎な壊死がみられた。1.0×10^9PFU以下のウイルス投与では組織に変化はなく、死亡例もなかった。
(2)AdexCAGhOTCとAdexSRαhOTCを比較すると同力価のウイルス投与でAdexCAGhOTCの方が非常に高いOTC活性を示した。OTC蛋白の発現はウエスタンブロッティング法によっても確認できた。
(3)AdexCAGhOTCを投与したマウスでは0.15×10^9PFU以上の投与で明らかな肝OTC活性の上昇がみられ、活性の上昇は投与量にほぼ比例した。肝OTC活性の上昇のみられた全てのマウスで尿中オロット酸が正常化した。0.5-1.0×10^9PFUでは、肝OTC活性は野生型に匹敵した。
以上の結果からCAGプロモーターを用いたOTC発現用組換えアデノウイルスベクターは、少量の投与で十分な臨床的効果を達成できることが示された。

研究成果

• [文献書誌] Matusda I.,et al.: "Zine supplementation inproves the conversion of T4 to T3 in disabled patients with zinc deficiency." J.Am.Coll.Nutr.13. 62-67 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et al.: "Expression of four mutant human ornithine transcarbamylase genes in cultured Cos 1 cells related to clinical phenotypes." Human Genet.93. 129-134 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et al.: "Deficiency of the Elb subunit in the branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex due to a single base substitution of the intron 5,resulting in two alternatively spliced mRNA in a patient with maple syrup urine disease." Biochim.Biophys.Acta.1225. 317-325 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et al.: "Characterization of a point mutation in the pyruvate dehydrogenase El α gene from two boys with primary lactic acidemia." J.Inh.Metab.Dis.17. 189-195 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et al.: "Four newly identified ornithine transcarbamylase (OTC) mutation (D126G,R129H,I172M and W332X) in Japanese male patients with early onset OTC deficiency." Human Mutation. 3. 402-406 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et.al.: "Homologous dinucleotide (GT or TG) deletion in Japanese patients with chronic granulomatous disease with p47-phox deficiency." Biochim.Biophys.Res.Comm.199. 1372-1377 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et al.: "Structural organization and analysis of the human fumarylacetoacetatehydlase gene in tyrosinemia type I." Biochim.Biophys.Acta.1220. 168-172 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et.al.: "Structure of the human 4-hydroxy phenylpyruvic acid dehydrogenase gene." Genomics.23. 534-539 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et al.: "Mutation in CoL 4A5 gene in alport syndrome : A possible mutation in primodial gern cells." Kidney Int.46. 1307-1317 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et al.: "The rat argininosuccinate lyase promoter : The dyad-symmetric CCAAT box sequence CCAATTGG in the promoter is recognized by NF-Y." J.Biochem.116. 1044-1055 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et al.: "Measurement of blood holoceruloplasmin by El α using a mouse monoclonal antibody directed to holoceruloplasmin. Implication for mass screaning." J.Inh.Metab.Dis.17. 616-620 (1994)
• [文献書誌] Matsuda I.,et al.: "Molecular analysis for the diagnosis of X-linked hyper-IgM syndrome." Biochem.Biophys.Acta.1260. 62-67 (1995)