| 研究課題/領域番号 |
06454611
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| 研究機関 | 兵庫医科大学 |
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研究代表者 |
島 知子 兵庫医科大学, 医学部, 助教授 (10172868)
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| 研究分担者 |
古山 順一 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (30068431)
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| キーワード | ATBF1 / co-transfection / ATBF1遺伝子産物(蛋白) / polyclonal抗体 / triplet repeat |
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| 研究概要 |
1.ATBF1発現ベクターをneo発現ベクターとともにco-transfectionを行った。細胞には、NIH-3T3(マウス線維芽細胞)とPC12(ラット褐色細胞腫)を用いた。co-transfection後にneo-selectionを行いそれぞれ約50個のクローンを得た。クローンの一部からDNAを抽出しPCRにてATBF1-cDNAの組み込みを検索したところ、約1/3でpositiveであったので、これらを継代した。しかし3回の継代後にcDNAが抜けていることが判明した。このことは、ATBF1がlog phaseよりむしろstationry phaseの細胞で発現が多い(未発表データ)ことと関連しているように思われる。すなわち、ATBF1-cDNAが発現すると細胞増殖にnegativeに働く結果、ATBF1発現の少ない細胞のみがクローンのexpansionの際に選択的に増殖したことを示唆している。このような現象は、癌抑制遺伝子の1つで細胞周期を抑制するRB遺伝子のtransfectionの際にもしばしば見出されており、ATBF1をtransfectionする細胞を選択する必要があると考えられる。
2.ATBF1遺伝子産物はその塩基配列から300kda以上の巨大な蛋白と考えられる。最近ATBF1はもう1つsplicingによるisoformがあることが判明し(投稿準備中)、この場合は約400kdaとなる。これらの蛋白を検出するには抗体が必要で、ATBF1の一部を大腸菌で発現させた蛋白を免疫原として抗体を調整したが、これまで適当なものが得られていなかった。今回、ホメオドメインの2カ所をそれぞれGST-fusion proteinとして大腸菌で発現させて得たペプチドを免疫原とした。ウサギでpolyclonal抗体を作製したところ、そのうち1方が特異的であることが判明した。またこのfusion proteinを用いての実験で、ホメオドメインを介してダイマー形成をする可能性が示唆されている。
3.ATBF1遺伝子内にあるtripled repeatについて、正常人におけるpolymorphismを検討した。成人30名の末梢血のDNAを用いてPCRにてrepeat部分をはさんで増幅した。その結果polymorphismは認められないことが判明した。
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