ヒトにおける紫外線損傷修復機構のタンパクレベルの研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06454637
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 二階堂 修 金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)
• 研究分担者: 石垣 靖人 金沢大学, 薬学部, 教務職員 (20232275) ; 鈴木 文男 金沢大学, 薬学部, 助教授 (10019672)
• キーワード: 損傷認識タンパク / シクロブタン型チミン二量体 / (6-4)光産物 / GAPD / 相補性群 / 損傷修復 / ヒト細胞 / 試験館内修復合成

研究概要

ヒトにおける紫外線損傷の修復機構に関する研究は、主として紫外線高感受性、皮膚がん好発性の遺伝疾患・色素性乾皮症の各種相補性群を相補する正常ヒト遺伝子のクローニングという戦略で行われてきた。その結果、全ての相補性群を相補する遺伝子のクローニングが完成した。一方、酵母における紫外線感受性突然変異株は数十種を数えることから、ヒトにおける紫外線損傷修復関連遺伝子には未だ発見されていないもののあることが推定される。そこで本研究では、遺伝子クローニング→タンパク機能の解析という通常の研究戦略とは全く逆の、ヒト細胞抽出液中の修復関連タンパクの分離→修復関連遺伝子の分離という方向で研究を実施することを目的とした。
ヒト細胞核抽出液中の修復関連タンパク、特に損傷の認識に携わるタンパクを分離するために、紫外線損傷を有するDNA断片を用いたゲルシフト法と、紫外線損傷認識抗体の紫外線照射DNAへの結合の競合的阻害を指標として実験を行った。
HeLa細胞核抽出液をヘパリン・カラムで分画したところ、第10番分画(NF-10)と第14番分画(NF-14)に紫外線照射DNAに結合するタンパク分子が存在していた。これらの分画についてさらにフラクト・ゲル・モノSカラムと分画を進めたところ、ポリアクリルアミド電気泳動で約40kDaの分子量をしめす単一タンパク分子を得た。分離されたタンパクの部分的分解によるアミノ酸配列の分析を行ったところ、このNF-10タンパクは、解糖系に関わるグリセラルデハイド・デハイドロジェネース(glyceraldehyde dehydrogenese:GAPD)と一致することが判明した。NF-10タンパクは、紫外線損傷を有するDNAに特異的に結合し、その結合動態から、紫外線損傷のうち(6-4)光産物を認識結合する可能性が示唆された。また、NF-10タンパクを特異的に認識するモノクローナル抗体を樹立し、試験管内修復合成系に添加したところ、紫外線損傷の修復合成が有意に抑制される結果を得た。今後は、NF-10タンパクに結合する関連タンパクの分離を行うと共に、NF-14分画中のタンパクを精製し、アミノ酸配列の解析から当該タンパク分子の遺伝子クローニングと、紫外線損傷修復過程への関与について解析を行う。

研究成果

• [文献書誌] T.Funayama: "Photorepair and excision repairl removal of UV-induced pyrimidine dimers and(6-4)photoproducts in the tail fin of the Medaka,Oryzias latipes." Journal of Rsadiation Research. 35. 139-146 (1994)
• [文献書誌] X.Qin: "Detection of active UV-photoproduct repair in monkey skin in vivo by quantitative immuno-histochemistry." Cancer Letter. 15. 291-298 (1994)
• [文献書誌] H.Morikawa: "Cloning of VH and VL genes for antibodies specific for pyrimidine photo dimers." Nucleic Acids Symposium Series. 29. 111-112 (1994)
• [文献書誌] A.A.Vink: "Removal of UV -induced DNA lesions in mouse epidermis soon after irradiation" Journal of Photochemistry and Photobiology,B. 24. 25-31 (1994)
• [文献書誌] T.Mori: "Characterization of three cloned cell lines from a N-nitorosobis (2-hydoroxypropyl)amine-induced transplantable hamster pancreatic ductal adenocarcinoma." International Journal of Pancreatology. 293. 143-150 (1994)
• [文献書誌] 鈴木文男: "アポトーシスの分子医学" p53と癌とアポトーシス(羊土社), 14 (1994)
• [文献書誌] 鈴木文男: "動物細胞代替法マニュアル" テトラゾリウム塩を用いた毒性試験法(MTT法)(共立出版社), 11 (1994)