| 研究概要 |
ブタ大動脈平滑筋抽出液をDEAE-Toyopearl 650Sカラムクロマトグラフィに供し、昨年度報告したミオシン重鎖キナーゼの他に、新たにEGTA存在下で活性を持つミオシン重鎖キナーゼが0.15M KCl付近で溶出することを見いだした。昨年度報告したキナーゼを、myosin kinase II(MKII)、新しいキナーゼをmyosin kinase I(MKI)と命名した。MKIを更にAffigel blue,およびSephacryl S 300カラムクロマトグラフィを用いて130倍まで精製した。ゲル濾過の溶出量から、分子量は4万と推定され、基質特異性は低く、プロタミンやカゼインの他に、ミオシンLC20のSerlおよびSer2も燐酸化した。[γ-^<32>P]ATPを基質とし、MKIで燐酸化したミオシン重鎖をトリプシン消化し、燐酸化ペプチドを単離した。配列分析から、燐酸化部位付近のアミノ酸配列はRGNETSFVPと決定され、6番目のSerが燐酸化されていた。この配列と既に報告されているミオシン重鎖のアミノ酸配列を比較すると、ペプチドC末端のProは、平滑筋ミオシン204-kDa重鎖のアミノ酸配列を比較すると、ペプチドC末端のProは、平滑筋ミオシン204-kDa重鎖アイソフォーム尾部先端の近くにあって、ヘリックスを崩すProの位置に相当していた。
一方、MKIIは分子量、サブユニット構成、酵素的性質、抗体との交錯反応から、カゼインキナーゼII(CKII)であることが示された。昨年度報告したように、MKII/(CKII)の燐酸化部位は、C末端のヘリックスの崩れた領域に存在していた。このように大動脈平滑筋ミオシン重鎖204-kDaアイソフォームにおいて、C末端付近のProをはさんで、ヘリックスおよびヘリックスの崩れた両領域に燐酸化部位の存在することは大変興味深い。
MKIおよびMKII/(CKII)により燐酸化した大動脈ミオシンは、アクチンで活性化されるATPase活性を変化させなかったが、MKIによる燐酸化は、ミオシンフィラメントを安定化することを見いだした。
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