生物発光技術の多面的開発

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06506001
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 磯部 稔 名古屋大学, 農学部, 教授 (00023466)
• 研究分担者: 日比 清勝 日本分光(株), 第2技術部, LC技術部課長 ; 市場 郁子 名古屋大学, 農学部, 助手 (40247680) ; 市川 善康 名古屋大学, 農学部, 助教授 (60193439)
• キーワード: ルシフェラーゼの固定化技術 / タンパク脱燐酸酵素阻害剤 / トートマイシン / 発光素子 / 生物発光 / 発光タンパク

研究概要

生物発光技術としては、すでにホタル生物発光系について、ルシフェリンフォスフェートの化学合成法・ルシフェラーゼの大腸菌による発現とその市販・ルシフェラーゼの固定化技術とその市販がすでに達成されている。我々はこれをもとに流れ分析技術を確立し、各種フォスファターゼによる加水分解の定性定量法の確立という観点から研究を進めほぼ基礎技術を確立することができた。さらに超高感度検出を目指して改良する努力をしている。
本年度は特に応用技術として、まず、PP2Aの触媒サブユニット(PP2AC)をウサギの骨格筋から単離・精製し、Cohenらの手法に準じて精製し、必要に応じて疎水性カラムを用いるなど改良した。タンパク脱燐酸酵素阻害剤であるオカダ酸・トートマイシン・カリキュリン・ミクロシスチンの4種類の代表的化合物すべてについて、このホタル生物発光に適用した結果、既報と一致することを確認した。さらに、本手法は通常の活性測定条件である弱アルカリ性だけではなく、中性からさらには弱酸性まで幅広いpH特性を持つという利点を明らかにした。トートマイシン(1)は2A型だけではなく1型のフォスファターゼに対しても同等の強い阻害活性を示すことが知られている。我々も、上で開発した活性評価法をPP1γに適応した。その結果、低親和性の阻害剤については慎重に適用する必要があるものの、特に高親和性の阻害剤について有効であることが明らかとなった。次に、確立した阻害活性評価法を用いて、その測定結果を基に、トトマイシン(1)の分子形状と活性との相関について探り、ジカルボン酸構造が活性型であることを初めて明らかにすることができた。
フォトンカウンティング方式の流れ分析およびバッチ分析のいずれにも切り替えて使用できる検出器の作成にも成功した。実際の使用例は、継続して最終年度にも検討する。

研究成果

• [文献書誌] Isobe,M.;Sugiyama,: "New Analysis Method for Protein Phosphatase Type 2A Inhibitors Using the Firefly Bioluminescence System" Biosci.Biotech.Biochem.59. 2235-2238 (1995)
• [文献書誌] Usami,K.;Isobe,M.: "Two Luminescent Intermediates of Coelenterazine Analog,Peroxide and Dioxetanone,Prepared by Direct Photo-oxygenation at Low Temperature," Tetrahedron Lett.,. 36. 8631-8616 (1995)
• [文献書誌] Sugiyama,Y.;Ohtani,I.I.;Isobe,M.: "Molecular Shape Analysis and Activity of Tautomycin,a Protein Phosphatase Inhibitor," Bioorganic & Medicinal Chemistry Lett.,. 6. 3-8 (1995)
• [文献書誌] Usami,K.;Isobe,M.: "Chemiluminescent Characters of Hydroperoxide and Dioxetanone of Coelenterate Luciferin Analog Prepared by Low-Temperature Photooxygenation" Chemistry Lett.,. _3. 215-216 (1996)