細胞マルチストレス応答解析装置の開発

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06555245
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 松岡 英明 東京農工大学, 工学部, 教授 (10143653)
• 研究分担者: 川名 明夫 NTT基礎研究所, 物質科学研究部, 川名研究グループリー ; 根本 泰行 東京農工大学, 工学部, 講師 (70202249)
• キーワード: 細胞内分子情報 / キチナーゼ / イネ培養細胞 / 活性染色法

研究概要

本年度は、細胞内の分子情報を得るための細胞質サンプリング法について検討した。吸引用キャピラリーの先端形状を種々検討し、先端を斜めに研磨して4mm×2mmの楕円形にしたものを用いた。イネ培養細胞(Oryza sativa L.)に刺入し、吸引圧254mmHgで細胞質のサンプリングを試みたところ、細胞質の一部がキャピラリー内部に吸引されることが認められた。しかし、その採取された細胞質の総タンパク質を定量するには至らなかった。因みに細胞質のタンパク質画分を電気泳動後、銀染色法で検出する場合の所要サンプル量は細胞約10個分であったので、細胞質の一部分(10%程度)のみで検出するためには検出感度を100倍上げる必要があると結論された。
一方、細胞質中の具体的な分子情報として、ストレス応答遺伝子の一つと考えられているイネ生葉キチナーゼに焦点を合わせ、その細胞内酵素活性の検出条件についても検討した。予備実験の結果、キチナーゼ活性を示すアイソザイムが数種類あることがわかったので、それらの生成パターンを同時に解析するために活性染色法を導入した。しかし従来の活性染色法では感度が低いため、高分子基質を含むゲル中で直接電気泳動する方法を新たに考案した。その結果、測定感度が向上し最少量2mm×2mmの生葉切片で各キチナーゼ活性アイソザイムの検出が可能になった。この生葉切片は細胞数にして約2.5×10^5個分に相当すると試算された。すなわち特定の酵素活性を直接検出するためには25万倍高感度の検出法を考案する必要があると結論された。
本年度は最終年度であるが、当初から最も困難と思われた細胞質サンプリング法に取り組んだ結果、上述のような定量的な見積もりを得ることができた。細胞内分子情報のイン・ビボ解析は、益々重要になってきているが、それを達成するためにはサンプリングすることなく、直接細胞内から外部に分子情報を発信できるようなシステムの開発も併せて検討する必要があると考えられた。

研究成果

• [文献書誌] Mikako Saito: "Application of Multifunctional Microeleectrode to the In Vivo Analysis of the K^+ Response to CO_2 Stress" Bioelectrochem.Bioenerg.39. 115-118 (1996)
• [文献書誌] Ki-Bong Oh: "Morphological Recognition of Fungal Spore Germination by a Computer-aided Image Analysis and Its Application to Antifungal Activity Evaluation" J.Biotechnology. 45. 71-79 (1996)
• [文献書誌] Mikako Saito: "Microiniection of Fluorescence Dye in a Plant Cell and Its Intercellular Translocation with a Multi-channel Microelectrode System" Biochim.Biophys.Acta. 1289. 1-4 (1996)
• [文献書誌] Kazuaki Yoshioka: "A Novel Fluorescent Derivative of Glucose Applicable to the Assessment of Glucose Uptake Activity of Escherichia coli" Biochim.Biophys.Acta. 1289. 5-9 (1996)
• [文献書誌] Ki-Bong Oh: "Rapid and Sensitive Screening of Antifungal Activity in Medicinal Plants by Single Cell Biosensing System." Biosci.Biotech.Biochem. 60. 911-913 (1996)
• [文献書誌] Jong-Chul Park: "Adaptation of Aspergillus niger to acidic conditions and Its Relation to Salt Stress and Miconazole" Mycologicl Research. 100. 869-874 (1996)
• [文献書誌] Jong-Chul Park: "Influence of Antifungal Pre-treatment in Preparing Test Mycelium on MIC Values of Several Antifungal Agents against Aspergillus niger" Mycoscience. 37. 117-120 (1996)
• [文献書誌] 呉基鳳: "バイオセンシング技術の展望" 防菌防黴. 23. 487-494 (1996)
• [文献書誌] 斉藤美佳子: "微笑電極を用いた細胞電位の測定" DENKIKAGAKU. 64. 107-111 (1996)
• [文献書誌] Hideaki Matsuoka: "Sensitive Detection of Antifungal Aactivity of Volatile Components Emitted from Plant Leaf Samples by Single Hypha Assay Method" Biocontrol Science. 1. 65-67 (1996)
• [文献書誌] Kazuaki Yoshioka: "Intracellular Fate of 2-NBDG,A Fluorescent Probe for Glucose Uptake Activity,in Escherichia coli Cells" Biosci.Biotech.Biochem.60. 1899-1901 (1996)
• [文献書誌] Kazuaki Yoshioka: "Evaluation of 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose,A New Fluorescent Derivative of Glucose,for Viability Assessment of Yeast Candida albicans" Appl.Microbiol.Biotechnol.46. 400-404 (1996)
• [文献書誌] 松岡英明: "農業環境における植物の細胞センシング" 農業機械学会誌. 58. 120-125 (1996)
• [文献書誌] 松岡英明: "植物バイオセルの計測-植物におけるシステミック応答機構の解明をめざして-" 蛋白質 核酸 酵素. (印刷中). (1997)