蛋白質分泌生産系を用いる血栓及び血栓溶解剤結合性単鎖2価抗体の生産と機能改良

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06556015
• 研究機関: 東京薬科大学
• 研究代表者: 山形 秀夫 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (20023468)
• 研究分担者: 岩佐 進 武田薬品工業(株), DDS研究所, 主席研究員 ; 加藤 雅士 名古屋大学, 農学部, 助手 (70242849) ; 太田 敏博 東京薬科大学, 生命科学部, 助教授 (10266893) ; 垣沼 淳司 名古屋大学, 農学部, 教授 (50252276)
• キーワード: 蛋白質分泌生産系 / バチルス・ブレビス / 単鎖2価抗体 / Fab断片 / 血栓 / 血栓溶解剤 / リンカーペプチド

研究概要

抗ウロキナーゼ抗体遺伝子のFab断片L鎖及びH鎖に相当する部分をPCR法により増幅し、B.brevisベクターに挿入した。このベクターを導入したB.brevisにおいてFabのL鎖及びH鎖がそれぞれ独立に分泌され、培養液中で会合してFab断片を形成することを確認した。Fab断片の蓄積量は培養液1リットル当り100mgに達した。培養液中のFab断片を精製し、その抗原に対する結合定数が元の抗ウロキナーゼ抗体と等しいことを確認した。
次に単鎖Fab断片の生産を行うため、FabのL鎖及びH鎖が正しい配置をとるようにL鎖のC末端とH鎖のN末端を連結するリンカーペプチドのデザインを行い、それをコードする合成DNAをL鎖及びH鎖遺伝子と連結してB.brevisベクターに挿入した。このベクターを導入したB.brevisにおいては培養液1リットル当り数mgの単鎖Fab断片の分泌が観察された。
B.brevisにおけるFab断片の分泌量は単純なフラスコ培養の結果としては、大腸菌等の他の系における結果より優れているが、B.brevisにおける他の蛋白質の分泌量と比べた場合まだ改善の余地があると考えられる。分泌ベクターの改変等、マグロ成長ホルモン等の他の蛋白質の分泌量の改善に有効であった方法を現在試みつつある。単鎖Fab断片の分泌量は期待された量よりはるかに少ないものであり、その原因の解明が必要である。現在リンカーペプチドの長さやアミノ酸配列を変化させ、その影響を系統的に調べつつある。一方分泌された、抗体蛋白質の折りたたみ過程の促進のために利用することを目的として、B.brevisのS-S結合酸化還元酵素遺伝子を単離した。またヒトPDIのB.brevisによる生産を行った。さらに血栓溶解能測定系の改良を目的としてStreptovericiliumの抗血液凝固因子を単離精製した。

研究成果

• [文献書誌] T.Ishihara: "Cloning and characterization of the gene for a protein thiol-disulfide oxidoreductase in Bacillus brevis." J.Bacteriol.177. 745-749 (1995)
• [文献書誌] Y.Sagiya: "Direct high level secretion into the culture medium of tuna growth hormone in biologically active form by Bacillus brevis." Appl.Microbiol.Biotechnol.42. 358-363 (1994)
• [文献書誌] T.Kurokawa: "Thrombolytic properties of an immunoconjugate between single-chain urokinase-type plasminogen activator(u-PA) and F(ab)_2 of bispecific monoclonal antibody against fibrin and against u-PA in hamsters." Fibrinolysis. 8. 126-133 (1994)
• [文献書誌] H.Tada: "Expression and characterization of a chimeric bispecific antibody against fibrin and against urokinase-type plasminogen activator." J.Biotechnol.33. 157-174 (1994)
• [文献書誌] H.Toji: "Production of human protein disulfide isomerase by Bacillus brebvis." J.Biotechnol.33. 55-62 (1994)
• [文献書誌] M.Tanabe: "Isolation and characterization of Streptoverticillium anticoaguland(SAC),anovel protein inhibitor of blood coagulation produced by Streptoverticillium cinnamoneum subsp.cinnamoneum." J.Biochem.115. 743-751 (1994)
• [文献書誌] S.Udaka(分担執筆): "Recombinant microbes for industrial and agricultural applications eds,Y.Murooka and T.Imanaka" Marcel Dekker,Inc., 877 (1994)