1光子励起レーザー走査型共焦点顕微鏡の開発を細胞内Ca^<2+>測定への応用

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06557003
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 久場 健司 名古屋大学, 医学部, 教授 (60080561)
• キーワード: 2光子励起 / 超短パルスレーザー / 細胞内Ca^<2+> / ニューロン / インド-1 / チタンサファイアレーザー / 蛍光測定 / 運動神経終末

研究概要

水冷アルゴンレーザー(8-12W)によりチタンサファイアレーザーを励起し、発生した超短波パルスレーザー(690-800nm、80-150frsec、80MHz、0.2-1W)によりレーザー走査蛍光測定装置(BIORAD,MRC-600)を使って、倒立顕微鏡(ニコン TMD/TE-300)を通してステージ上の試料面を走査し、励起された蛍光を同蛍光測定装置で測定する二光子励起レーザー顕微鏡を開発した。蛍光ビーズ(0.3μm、700nm励起)による測定で、空間解像力0.3-0.4μm、光軸方向解像力0.3-0.4μmが得られた(対物レンズ CF Fluor 40*、開口率0.85)。空間及び光軸方向解像力は対物レンズの開口率が大きいほど良く、特に光軸方向に対してその効果は顕著であった。又、蛍光の明るさは、対物レンズの開口率と透過率に依存した。励起される試料の領域が焦点面に限定される為、蛍光物質の退色が、単光子励起レーザー顕微鏡に比べて数倍遅かった。Ca^<2+>感受性蛍光物質であるIndo-1やFura-2の励起スペクトラムが単光子励起のスペクトラムから予想される帯域より短波長側へ(二光子励起波長で約20nm)移動することが見られた。培養した海馬ニューロンやウシガエル交感神経節細胞のCa^<2+>感受性プローブによる詳細な三次元蛍光画像が得られ、前者の樹状突起やスパインや後者の神経突起の微細な構造が観察され、高K^+液による細胞内Ca^<2+>上昇が記録された。又、二光子励起による細胞内Ca^<2+>測定の対照実験として単光子励起による実験で、カエル運動神経終末ライアノジン受容器を介するCa^<2+>誘導性Ca^<2+>遊離の詳細な機構が解明された。

研究成果

• [文献書誌] Yoshizaki,K.: "Ca^<2*>-induced Ca^<2+> release and its activation in response to a single action potential in rabbit otic ganglion cells." J.Physiol.(Lond). 486. 177-187 (1995)
• [文献書誌] Hua,S.-Y.: "Cyclic ADP-ribose Modulates Ca^<2+> release chainiels-for activation by physiological Ca^<2+> entry in bullfrog sympathetic neurones" Neuron. 12. 1073-1079 (1994)
• [文献書誌] Kuba,K.: "A UV laser-scanning confocal microscope for the measurement of intracellular Ca^<2+>" Cell Calcium. 16. 205-218 (1994)
• [文献書誌] Kuba,K.: "Ca^<2+>-induced Ca^<2+> release in neurones" Jpn.J.Physiol.44. 613-650 (1994)
• [文献書誌] 久場健司: "共焦点レーザー顕微鏡による細胞内Ca^<2+>濃度の測定" 日本生理学雑誌. 58. 115-124 (1996)
• [文献書誌] 久場健司: "シナプスのCa^<2+>動態" 生体の科学. 47. 105-114 (1996)
• [文献書誌] 久場健司: "シナプス伝達のダイナミクス" 培風館, 146 (1995)
• [文献書誌] 久場健司: "新しい光学顕微鏡第2巻 第3章-5-(3) 「ニューロンのCa^<2+>動態」" 学際企画, 199 (1995)