生物発光を用いた遺伝子発現のリアルタイム・モニタリングシステムの開発

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06557005
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 本間 研一 北海道大学, 医学部, 教授 (40113625)
• 研究分担者: 石浦 正寛 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助手 (20132730) ; 近藤 孝男 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助手 (10124223) ; 篠原 一之 北海道大学, 医学部, 助手 (30226154) ; 安倍 博 北海道大学, 医学部, 助手 (80201896) ; 本間 さと 北海道大学, 医学部, 助教授 (20142713)
• キーワード: 生物発光 / 遺伝子発現 / ルシフェラーゼ / トランスフォーマント / 神経ペプチド / 細胞培養 / サーカディアンリズム / フォトカウント

研究概要

本年度は、1)培養細胞における神経ペプチド動態の基礎的検討、2)生物発光の生体内増幅系の構築、および3)超高感度光検出解析システムの開発、を行い以下の実績を得た。
1)ラット視床下部視交差上核神経系の細胞培養および器官培養系を確立し、数週間から数ケ月の培養を可能にした。さらに、培養液中に分泌される神経ペプチド(AVP:arginine-vasopressin、VIP:vasoactive intestinal peptide)の連続測定法を開発した。予備的実験では、AVPおよびVIP分泌は24時間に近い周期のリズムを示し、長期培養でも安定して変動することが示された。
2)生物発光を触媒するルシフェラーゼ(ホタル)遺伝子を改良し、細胞培養での発現を飛躍的に上昇させた。その遺伝子コード領域の上流にニワトリのアクチン遺伝子プロモータを連結させ、融合遺伝子を作成した。この融合遺伝子をネオマイシン耐性のベクター(pBact-STneoB)に移して、マウス線維芽細胞(Ltk細胞)に移入し、G418で選択してトランスフォーマントを得た。現在、測定バイヤル中でサブカルチャーし、ルシフェリン存在下で生物発光を測定中である。
3)生物発光自動測定装置にフォント計数法を導入し、極く微弱な生物発光の測定を可能とした。ノイズ対策として、低ノイズ光電子倍増管を使用し、信号処理経路にフォトンカウンターを導入した。これにより、ノイズレベルが著しく低下し、実行感度が10〜50倍に増大した。この装置は現在得られる最も高感度の測定システムであり、発光量が極めて微弱と考えられる培養細胞の実験系にも対応できると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Shinohara,K.,et al.,: "Circadian rhythm in the release of vasoactive intestinal polypeptide and vasopressin in organotyptic slice culture of rat suprachiasmatic nucleus." Neurosci.Lett.170. 183-186 (1994)
• [文献書誌] Mitome,M.et al.,: "Prefeeding increase in paraventricular noradrenaline release is regulated by a feeding-associated rhythm in rats." Am.J.Physiol.266. E606-E611 (1994)
• [文献書誌] Kanematsu,N.,et al.,: "Immediate response to light of rat pineal melatonin rhythm:analysis by in vivo microdialysis." Am.J.Physiol.266. R1849-R1855 (1994)
• [文献書誌] Abe,H.et al.,: "Circadia modulation in photic induction of Fos-like immunoreactivity in the suprachiasmatic nucleus cells of diurnal chipmunk,Eutaminas asiaticus." J.Comp.Physiol.A. 176. 159-167 (1995)
• [文献書誌] Kondo,T.et al.: "Circadian rhythms of cyanobacteria:Monitoring the biological clock of individual colonies by bioluminescence." J.Bacteriol.176. 1881-1885 (1994)
• [文献書誌] Kondo,T.et al.: "Circadian clock mutants of cyanobacteria." Science. 266. 1233-1236 (1994)
• [文献書誌] Hiroshige,T.and K.Honma: "Evolution of Circadian Clock" Hokkaido University Press, 428 (1994)