| 研究課題/領域番号 |
06557005
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
環境生理学(含体力医学・栄養生理学)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
本間 研一 北海道大学, 医学部, 教授 (40113625)
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| 研究分担者 |
石浦 正寛 名古屋大学, 理学部, 助教授 (20132730)
近藤 孝男 名古屋大学, 理学部, 教授 (10124223)
篠原 一之 横浜市立大学, 医学部, 助手 (30226154)
本間 さと 北海道大学, 医学部, 助教授 (20142713)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1996
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| キーワード | ルシフェレース / 生物発光 / カルシウムイオン / エコーリン / NIH3T3 / レポーター遺伝子 / 遺伝子発現 / リアルタイム・モニタリング |
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| 研究概要 |
1)生物発光の生体内増幅系の構築:ルシフェレース遺伝子のコード領域上流にニワトリ・アクチン遺伝子プロモータを連結させ、融合遺伝子を作成した。この融合遺伝子をネオマイシン耐性ペクター(pBact-STneoB)に移して、マウス繊維芽細胞に移入し、G418で選択してトランスフォーマントを得た。ルシフェリン存在下で生物発光を測定したが、充分な発光量は得られなかった。そこで、神経ペプチドであるアルギニン・バゾプレッシン(AVP)遺伝子のプロモータを利用し、レポーター遺伝子を作成した。次いで、AVP発現細胞であるラット視交叉上核細胞に移入して、トランジェントで生物発光を測定した。また、MVプロモータの下流領域にエコーリン遺伝子を挿入したベクター(PRK7)を作成し、培養NIH3T3細胞に移入した。遺伝子導入36時間後に、Caイオンを用いて生物発光を誘導したところ、Caイオンによる発光量は容量依存的に増加し、トランスフェクトされた遺伝子の発現が確認された。
2)超高感度光検出システムの開発:生物発光の自動測定にフォント計数法を採用し、極く微弱な生物発光の測定を可能とした。また低ノイズ光電子倍増管を使用し、信号処理経路にフォトンカウンターを導入した。これによりノイズレベルが著しく低下し、実行感度が10〜50倍に増大した。
3)細胞培養系の確立と神経ペプチドの経時的測定:ラット視床下部視交叉上核細胞の分散培養および器官培養系を確立し、数週間から数ヶ月の連続培養を可能にした。さらに、培養液中に分泌される神経ペプチド(AVPとVIP)のサーカディアンリズムを数サイクルに渡って測定した。
4)遺伝子発現と生物発光の関係:エコーリン遺伝子を移入したNIH3T3細胞をKC1で脱分極させたところ、発光量が瞬時に増加し、その増加は40秒ほど持続した。生きている細胞でエコーリン遺伝子の発現が確認され、レポーター遺伝子としての役割が証明された。
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