電気泳動ゲル内DNA修復関連酵素検出のための活性ブロッティング法の確立と応用

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06557013
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 関 周司 岡山大学, 医学部, 教授 (50032884)
• 研究分担者: 秋山 公祐 岡山大学, 医学部, 助手 (30222540) ; 渡辺 晰子 岡山大学, 医学部, 助手 (30093719)
• キーワード: DNA修復酵素 / DNase I / APEXヌクレアーゼ / DNA3′修復ジエステラーゼ / 活性ゲル / 活性ブロッティング / ウエスタンブロッティング / ゲル電気泳動

研究概要

細胞のDNAは幾多の損傷を受けているが、通常はDNA修復系で元通りに修復されて遺伝情報が維持されている。また、アポトーシスの様に処理される細胞もあるが、その際DNAはDNaseで消化される。我々は、これらの過程に関与する酵素を研究するため、電気泳動ゲル内DNA修復関連酵素検出法を考案し、活性ブロッティング法と命名した。本法は(1)損傷DNA固定化膜の作成(2)タンパク質をゲル電気泳動で分画する過程、(3)タンパク質再生過程、(4)再生タンパク質(活性)をDNA固定化膜にブロッティングする過程、(5)目的とするタンパク質(活性)を検出する過程からなるが、本年度はそれぞれの過程をexonuclease III、DNase I、ヒトの主要なAP endonuclease(APEXヌクレアーゼ)等を含む標品をゲル電気泳動して検出条件を決めた。DNA固定化膜は、ナイロン膜をDNA溶液に浸し、風乾することによって作成し、DNA損傷はbleomycin処理、酸処理、X線照射等で導入した。電気泳動はSDS-PAGEについて検討し、泳動後SDSを除きタンパク質を再生する条件を決めた。活性ブロッティングは、ゲル上にDNA固定化膜を置き、30℃で毛細管現象を利用したブロッティング(capillary blotting)で良い結果が得られた。細胞や組織の粗抽出標品から5′AP endonuclease、DNA 3′repair diesterase、DNase I等の酵素活性を本法で半定量的に測定することが可能となった。SDS-PAGEのタンパク質バンドと活性ブロッティングの結果とを対比することにより、活性を示す酵素とその活性な断片を当該ゲル上に指定することができた。標的酵素がそれぞれ特定のDNAにpriming作用を示すので、DNA合成系を検出系とし、ラジオアイソトープ検出系と非放射性検出系を確立した。本活性ブロッティング法と従来から行われている活性ゲル法との直接的比較を試み、本法の高い有用性を示した。

研究成果

• [文献書誌] Mitomo,K.,他5名: "Two different cellular redox systems regulate the DNA-binding activity of the p50 subunit of NF-kB in vitro." Gene. 145. 197-203 (1994)
• [文献書誌] Akiyama,K.,他3名: "Structure,promoter analysis and chromosomal assignment of the human APEX gene." Biochim.Biophys.Acta. 1219. 15-25 (1994)
• [文献書誌] Ono,Y.,他4名: "Stable expression in rat glioma cells of sense and antisense nucleic acids to a human multifunctional DNA repair enzyme,APEX nuclease." Mutation Research,DNA rapair. 315. 55-63 (1994)
• [文献書誌] Hongo,A.,他3名: "A comparison of in vitro platinum-DNA adduct formation between carboplatin and cisplatin." Int.J.Biochem.26. 1009-1016 (1994)
• [文献書誌] 秋山公祐、他6名: "非放射性ザイモグラフ(活性ブロッティング)法によるDNA修飾酵素の検出" 第17回日本分子生物学会年会講演要旨集. 17. 468 (1994)
• [文献書誌] Akiyama,K.,他5名: "Cloning,sequence analysis and chromosomal assignment of the mouse Apex gene." GENOMICS. (in press). (1995)
• [文献書誌] Ono,Y.,他6名: "Developmental expression of APEX nuclease,a multifunctional DNA repair enzyme,in mouse brains." Developmental Brain Res.(in press). (1995)