電気泳動ゲル内DNA修復関連酵素検出のための活性ブロッティング法の確立と応用

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06557013
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 関 周司 岡山大学, 医学部, 教授 (50032884)
• 研究分担者: 秋山 公祐 岡山大学, 医学部, 助手 (30222540) ; 渡邉 晰子 岡山大学, 医学部, 助手 (30093719)
• キーワード: DNA修復酵素 / DNase I / APEX AP endonuclease / 等電点電気泳動 / アイソザイム / 活性ブロッティング / ウエスタンブロッティング / ヒトグリオーマ細胞

研究概要

DNA修復関連酵素の検出・同定は、細胞の遺伝情報維持機構解明のためにも、突然変異、がん、分子病等の成立の分子機構解明のためにも重要である。本研究では、このDNA修復関連酵素の電気泳動ゲル内検出法を昨年に引き続き検討して、次のような成果を得た。
1.6種のヒトグリオーマ細胞株について、主要なAP endonucleaseであるAPEX nucleaseのmRNAの発現をnorthern blot hybridization法で、APEX AP endonucleaseの活性を本活性ブロッティング法で測定した結果、mRNA発現量と活性とがよく相関し、粗抽出液で特定のAP endonuclease活性を比較するのに極めて有用な方法であることを示した。また、これら細胞株のAPサイトを生じる薬剤に対する抵抗性と本法で測定したAPEX AP endonucleaseの活性の間に正の相関性が認められた。
2.DNase Iの粗抽出標品をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画したのち、本法によって感度よく半定量的に検出することができた。そして、本法によりDNase I活性の臓器間比較が可能であった。
3.DNase Iを等電点電気泳動で分画した後、本法によりDNase Iアイソザイムの分離・検出が可能で、粗抽出標品でアイソザイムパターンの臓器間比較が可能であった。
4.ブロッティングの過程は、capillary blottingでもelectroblottingでも可能であったが、前者の方が優れていた。
5.これら活性は、^<32>P-dCTPを用いるラジオアイソトープ法でもDigoxygenin-dUTPを用いる非アイソトープ法でも、検出可能であった。Digoxygenin-dUTPを用いる方法は、RI区域外での実施が可能で、検出時間が短時間ですむ利点があったが、バックグラウンドが高くなりむらになる傾向が認められた。

研究成果

• [文献書誌] Akiyama, Kosuke: "Cloning, sequence analysis, and chromosomal assignment of the mouse Apex gene." GENOMICS. 26. 63-69 (1995)
• [文献書誌] Ono, Yasuhiro: "Developmental expression of APEX nuclease, a multifunctional DNA repair enzyme, in mouse brains." Developmental Brain Res.86. 1-6 (1995)
• [文献書誌] Ono, Yasuhiro: "Relationship between expression of a major apurinic/apyrimidinic endonuclease (APEX nuclease) and susceptibility to genotoxic agents in human glioma cell lines." J. Neuro-Oncology. 25. 183-192 (1995)
• [文献書誌] Sarker, Altaf H.: "Oxygen radical-induced single-strand DNA breaks and repair of the damage in a cell-free system." Mutat. Res.337. 85-95 (1995)
• [文献書誌] Sarker, Altaf H.: "Purification and characterization of an AP endonuclease/DNA 3´repair diesterase from mouse ascites sarcoma cells." Biochim. Biopys. Acta. 1245. 299-304 (1995)