| 研究課題/領域番号 |
06557018
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 研究機関 | 慶応義塾大学 |
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研究代表者 |
浅井 隆志 慶応義塾大学, 医学部, 講師 (50175163)
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| 研究分担者 |
上田 政和 慶応義塾大学, 医学部, 助手 (50142419)
奥沢 英一 慶応義塾大学, 医学部, 助手 (20177166)
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| キーワード | 寄生虫 / 原生動物 / トキソプラズマ / NTPase / PCR / 遺伝子診断 |
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| 研究概要 |
トキソプラズマのNTPaseには二種類のアイソザイムが存在することがわかっていたが、どちらの遺伝子も検出できるようにプライマーの設計を行った。必要条件として、両アイソザイムの遺伝子の共通塩基配列であること、すなわち同一のプライマーで両アイソザイムの遺伝子を増幅可能であること、また産物の同定が容易にできるようにある程度長さのあるDNAが増幅されることを考慮した。その結果プライマーとして選んだ塩基配列はセンス側が5′-CGTGTCAGTTTCGTTTATGC-3′アンチセンス側が5′-GAACGACGGTTGATTTTCTC-3′であった。銅板プレート型の機械でファーストデイネチャーを92℃で5分、40回リピートでアニーリング64℃1分、エクステンション72℃1分、デイネチャー92℃で0.5分、そしてラストエクステンションを72℃で5分行った。この反応で約800bpのDNAが増幅し、特異的制限酵素サイトの存在から目的のDNAであることがわかった。ブロックヒーター型の機械ではデイネチャーを94℃、アニーリングを65℃で同一の結果がえられた。またフリーマグネシウムが4mM付近が最適の濃度であった。この条件では最低タキゾイト虫体10個以上あれば検出可能であった。現在トキソプラズマ感染動物組織からの虫体DNAの検出及びRNA-PCR法によるmRNAの検出を検討中である。増幅産物を制限酵素で切断しないアイソザイムに対応する遺伝子の種類を同定したところ、実際には発現されていない遺伝子が存在しているらしいことが判明した。また病原性の強い株と弱い株ではアイソザイムに違いがあることが新たに判明した。
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