グルコースで調節可能なインスリン発現ベクターを用いたラット糖尿病の遺伝子治療

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06557051
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 竹内 利行 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (00109977)
• 研究分担者: 誉田 芳孝 群馬大学, 生体調節研究所, 講師 (90261867) ; 河津 捷二 群馬大学, 医学部, 助教授 (30134547)
• キーワード: インスリン / PEPCK / PK / 発現ベクター

研究概要

本年度は肝細胞や筋肉細胞で制御可能なインスリン発現ベクターを作成した。インスリンは膵β細胞からグルコース濃度に応答して血中に分泌される。本研究では、この外部刺激に応答してインスリンを分泌する制御システムを肝細胞や筋細胞に遺伝子工学を用いて作成する。そのため、我々はグルコースで活性化されるPyruvate kinase(PK)プロモーターと、インスリンで抑制されるphosopho-enol-pyruvate carboxykinase (PEPCK)プロモーター下にインスリンDNAを組み込んだ発現ベクターを作成し、肝細胞由来H35株に導入した。PKプロモーターのグルコース応答エレメントは約30ヌクレオチドから成るのでこのユニットを1〜40迄複数結合したベクターを作り、グルコース応答インスリン産生を調べた。しかしインスリン分泌量はわずかで、しかもグルコースによる増加は観察できなかった。そこでPEPCKプロモーターを1〜6迄複数結合したベクターでインスリン分泌を検討した。PEPCKプロモーターはcAMP、デキサメサゾン(Dex)、レチノイン酸(RA)で活性化され、インスリンでネガティブフィードバックをうける。6個のベクターを作成したが、その中、2個のPEPCKプロモーターと基本プロモーターとしてチミジンキナーゼプロモーター下にインスリンDNAを結合したDNAを発現するH35が最もよくcAMP,Dex, RAに反応してインスリンを分泌した。H35培養液にインスリンを加えるとH35に導入したインスリンmRNAの発現は減少し、予想通り、インスリンによってネガティブフィードバックがかかった。次年度はこのインスリン発現ベクターをアデノウィルス導入系に組み入れてin vivoでインスリン分泌の調節を試みる。

研究成果

• [文献書誌] K. Takahasi, T. Fujita, T. Takeuchi.: "Production of bioactive enkephalin from the neuroendocrine cell lines COS-7, NIH3T3,Ltk^-, and C2C12." Peptides. 16. 933-938 (1995)
• [文献書誌] T. Kayo,Y. Sawada, Y. Suzuki, et al.: "Expression of the constitutive pathway-endoprotease furin mediates the decrement of well-differentiated characteristics of pancreatic β cell line MIN6." J. Biol. Chem.(印刷中). (1996)
• [文献書誌] T.Nishigori, M. Yanagita, T. Takeuchi.: "Proinsulin cleaved by furin is processed to chromatographically mature insulin by carboxypeptidases in non-neuroendocrine cells." Peptides. (印刷中). (1996)
• [文献書誌] 竹内利行: "臨床遺伝医伝医学:糖尿病の遺伝子治療" 診断と治療社, 12 (1995)
• [文献書誌] 竹内利行: "分子糖尿病学の進歩:プロインスリンのプロセシング" 金原出版社(印刷中), (1996)