グルコースで調節可能なインスリン発現ベクターを用いたラット糖尿病の遺伝子治療

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06557051
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 竹内 利行 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (00109977)
• 研究分担者: 誉田 芳孝 群馬大学, 生体調節研究所, 講師 (90261867) ; 河津 捷二 群馬大学, 医学部, 助教授 (30134547)
• キーワード: インスリン / PEPCK / 糖尿病治療 / アデノウイルスベクター

研究概要

我々は肝細胞など非内分泌系細胞に広く存在する蛋白分解酵素Furinで正しくプロセシングをうける変異インスリンcDNAを作成し、このcDNAを発現させてインスリン産生の調節を試みた。我々はインスリンで発現が抑制されるPhosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)のプロモーターを1〜6個チミジンキナーゼやβアクチンの基本プロモーターの前に配置したDNAを作成し、インスリン刺激伝達が伝わるラット肝由来の培養細胞H4IIEに導入・発現させた。作成した6つのDNAの中で3つのPEPCKプロモーターをTKプロモーターの前に配置したものがcAMP刺激に応じたインスリン分泌の増加を示した。そこでこのDNAを導入した細胞をcAMP、デキサメサゾン、レチノイン酸で刺激すると用量依存的にインスリンを産生分泌した。インスリンによるインスリン産生の抑制は観察が難しいので、我々は外部からメディウム中に投与したインスリンによって細胞内インスリンmRNA発現が抑制する程度を観察した。cAMPやデキサメサゾン等の産生刺激剤を加えないとmRNA発現は0.1nM程度の低いインスリン濃度で抑制された。cAMPとデキサメサゾン存在下ではmRNA発現は10nM程度の高いインスリン濃度で抑制された。インスリンmRNA発現の抑制にはまだ若干の問題があるが、我々は次に初代培養肝細胞を用いたインスリン発現実験に進んだ。次に効率のよいDNA導入をアデノウイルスベクターで行なうため、TK又はβアクチンプロモーターの前にPEPCKプロモーターを3つ配置したインスリン発現アデノウイルスベクターを作成した。初代培養肝細胞でもこのベクターを感染させると、グルカゴン、cAMP、デキサメサゾン、レチノイン酸によるインスリン産生増加が観察された。現在このアデノウイルス発現系を用いて、ストレプトゾトシン糖尿病モデルラットを作成し、治療実験を行なっている。

研究成果

• [文献書誌] T.Kayo,Y.Sawada,Y.Suzuki,et al.: "Proprotein-processing endoprotease furin decreases regulated secretory pathway-specific proteins in the pancreatic β cell line MIN6" J.Biol.Chem.271. 10731-10737 (1996)
• [文献書誌] T.Nishigori,M.Yanagita,T.Takeuchi.: "Proinsulin cleaved by furin is processed to chromatographically mature insulin by carboxypeptidases in non-neuroendocrine cells." Peptides. 17. 789-796 (1996)
• [文献書誌] T.Kayo,Y.Konda,S.Tanaka,et al.: "Developmental expression of proprotein-processing endoprotease furin in rat pancreatic islets." Endocrinology. 137. 5126-5134 (1996)
• [文献書誌] D.Lu,H.Hoshino,T.Takeuchi.: "Regulatable production of mature insulin from a hepatocyte cell line : insulin production is up-regulated by cAMP and glucocorticoids,and down-regulated by insulin" FEBS Lett.399. 37-42 (1996)
• [文献書誌] Y.Sawada,H.Yokoyama,M.Inoue,et al.: "Stretch-induced hypertrophic growth of cardiocytes and processing of brain-type natriuretic peptide are controlled by proprotein-processing endoprotease furin." FEBS Lett.400. 177-182 (1997)
• [文献書誌] K.Takahashi,Y.Liu,N.Hayashi,et al.: "Production of bioactive salmon calcitonin from the nonendocrine cell lines COS-7 and CHO." Peptides. (印刷中). (1997)
• [文献書誌] 竹内利行: "分子糖尿病学の進歩:プロインスリンのプロセシング" 金原出版社, 9 (1996)
• [文献書誌] 竹内利行: "インスリン分泌機構:調節性分泌と構成性分泌" 科学評論社, 14 (1997)