インスリン分泌障害をきたす遺伝子異常症の簡易診断法の開発と新たな候補遺伝子の同定

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06557056
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 岡 芳知 山口大学, 医学部, 教授 (70175256)
• 研究分担者: 谷沢 幸生 山口大学, 医学部,附属病院, 医員 ; 奥屋 茂 山口大学, 医学部, 助手 (20214083) ; 井上 康 山口大学, 医学部,附属病院, 助手 (10176448) ; 松谷 朗 山口大学, 医学部,附属病院, 講師 (10190464) ; 矢賀 健 山口大学, 医学部,附属病院, 講師 (10166473)
• キーワード: ミトコンドリア / 糖尿病 / グルコキナーゼ

研究概要

ミトコンドリア遺伝子異常の検索には、塩基配列特異的オリゴヌクレオチド(SSO)を用いたドットハイブリダイゼイションが、条件をうまく設定すれば、感度と簡便性の点で優れていることがあきらかとなった。具体的には、まず目的の変異を含んだ配列からなる19ベース程度のオリゴヌクレオチド(SSO)を合成し標識する。ミトコンドリア遺伝子の検索する部位を含んだDNA断片を患者DNAからPCRにて増幅し、これを一本鎖に変性させてナイロン膜にスポットし、標識したSSOをプローブとしてハイブリダイゼイションを行う。これにより、3243位の変位においては、糖尿病の患者のサンプルで、従来の方法では見出せなかったheteroplasmyの割合の低い患者からも変異を検出することができた。さらにこの方法を用いてロイシンtRNAの領域をスクリーニグした。300人の糖尿病患者では、3251位、3256位、3271位など、従来ミトコンドリア脳筋症で認められている部位の変異は認められなかったものの、2人に3290位の変異を認め、さらに検索したところ、850人中4人にこの変異を認めた。また、インスリン分泌障害をきたしうる新たな候補遺伝子としてグルコキナーゼ活性調節蛋白をクローニングし、マウスインスリノーマ由来細胞株MIN6に発現させることに成功した。さらに、グリセロールシャトルのkey enzymeのFAD-PHのcDNAのクローニングも行い、MIN6に発現させてグルコース刺激によるインスリン分泌を検討した。

研究成果

• [文献書誌] Katagiri H et al: J.Biol Chem. 270(印刷中). A novel isoform of syntaxin-binding protein homologous to yeast Secl expressed ubiquitously in mammalian cells. (1995)
• [文献書誌] Ishihara H et al: "Overexpression of hexokinase I but not.GLUTI glucose transporter alters concetration-dependency of glucose-stimulate insulin secretion in pancreatic b-cell line MIN6." J Biol Chem. 269. 3081-3087 (1994)
• [文献書誌] Inukai K et al: "Replacement of both tryptophan residues at 388 and 412 completely abolished cytochalasin B photolabelling of GLUTI glucose transporter." Biochem J.302. 355-361 (1994)
• [文献書誌] Morita Y et al: "Glucose transporter GLUTI mRNA expression in the ontogeny of glucose incorporation in mouse preimplantation embryos." Biochem Biophys Res Commun. 199. 1525-1531 (1994)
• [文献書誌] Katagiri H et al: "Mitochondrial diabetes mellitus: prevalence and clinical characterization of diabetes due to mitochondrial tRNALeu(UUR)gene mutation in Japanese." Diabetologia. 37. 504-510 (1994)
• [文献書誌] Morita Y et al: "Application of reverse transcription-polymerase chain reaction to study the glucose transporter protein gene(GLUT)expression in preimplantation mouse embryo." J Mamm Ova Res. 11. 1-7 (1994)