凍結転移法を応用した新しいin situハイブリダイゼーション法の開発

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06557094
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 栗栖 浩二郎 大阪大学, 歯学部, 教授 (50028346)
• 研究分担者: 竹下 佐和子 生化学工業(株), 研究員 ; 田畑 純 大阪大学, 歯学部, 助手 (20243248) ; 加藤 穣慈 大阪大学, 歯学部, 助手 (90243245) ; 岩本 容泰 大阪大学, 歯学部, 講師 (30223431) ; 脇坂 聡 大阪大学, 歯学部, 助教授 (40158598)
• キーワード: 遺伝子発現 / mRNA / PCR法 / ニトロセルロース膜 / 冷凍切片 / RNAプローブ / ディゴキシゲニン / in situ ハイブリダイゼーション

研究概要

In situ hybridization(ISH)法は組織レベルで遺伝子発現の局在を検討する方法である。しかし、従来のISH法は技術的に複雑で経験を必要とし、また、歯牙・骨・軟骨等の硬組織を含む切片では、実験操作中に切片が剥離しやすい、また、豊富な細胞外基質が存在する為に、プローブの非特異的結合によりバックグラウンドが上昇しやすいなどの欠点があった。そこで、今回我々は凍結転移法を応用することにより、従来法と比較して簡単で、十分高い感度を有する新しいISH法を確立した。
試料をOCTコンパウンドに包埋して8μm厚の凍結切片を作製した。凍結切片をニトロセルロース膜に転写した後、10μg/mlのprotenase Kで20分間処置し、4%PFAで再固定の後、digoxigenin標識した種々のマトリックス遺伝子のRNAプローブとハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は65℃で行った。また、同様の切片を用いて従来法のISHも行なって標的mRNAの検出感度の比較を行なった。
ニトロセルロース膜上でのISH法では、従来法よりも高いシグナルを有しながらバックグラウンドがほとんど認められない像が得られた。また、本方法は、従来のスライドグラス上で行うISH法と比較して、I)プレハイブリダイゼーション以後のステップをエッペンチューブあるいはマルチウェルプレート内で行うことが出来るので実験操作が非常に簡単である、II)mRNAが膜に結合する為に微量なmRNAの保持が確実となりシグナルが上昇する、III)激しい洗浄が可能なためバックグラウンドが減少する、などの利点があることが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] S.Wakisaka: "Partial coexistence of neuropeptide Y and calbindin D28k in the trigeminal ganglion following peripheral axotomy of the inferior alveolar nerve of the rat." Brain Res.707. 228-234 (1996)
• [文献書誌] M.J.Tabata: "Hepatocyte growth factor is involved in the morphogenesis of tooth germ in murine molars." Development. 122(in press). (1996)
• [文献書誌] J.Kato: "Immunohistochemical changes in the distribution of nerve fibers in the periodontal ligament during an expeimental tooth movement of the rat molar." Acta Anat.(in press). (1996)
• [文献書誌] S.Wakisaka: "Distribution and possible origin of galanin-like immunoreactive nerve fibers in the mammalian dental pulps." Regul.Peptides. (in press). (1996)
• [文献書誌] S.Wakisaka: "Protein gene product 9.5 in the developing mouse circumvallate papilla;comparison with neuron specific enolase and calcitonin gene related peptide." Anat.Embryol.(in press). (1996)
• [文献書誌] S.Wakisaka: "Neuropeptide Y-like immunoreactive primary afferents in the dental pulp and periodontal ligament following peripheral nerve injury to the inferior alveolar nerve in the rats." Brain Res.(in press). (1996)
• [文献書誌] K.C.Kajander: "Fos-like immunoreactivity increase in the lumbar spinal cord after a chronic constriction injury to the sciatic nerve." Pain. (in press). (1996)
• [文献書誌] M.Takemura: "NADPH-diaphorase in the developing rat:Lower brainstem and cervical spinal cord with special refernce to trigeminal-solitary complex." J.Comp.Neurol.(in press). (1996)