新しい炎症増幅因子の精製と骨・軟骨疾患診断薬としての応用

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06557097
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 加藤 幸夫 広島大学, 歯学部, 教授 (10112062)
• 研究分担者: 早川 太郎 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (80064822) ; 岡田 保典 金沢大学, がん研究所, 教授 (00115221) ; 能城 光秀 広島大学, 歯学部, 助教授 (00144858)
• キーワード: 骨 / 軟骨 / オステオネクチン / アミロイド / インターロイキン-1 / 炎症

研究概要

歯周病や顎関節症では、炎症にともなって骨と軟骨の破壊が起こる。しかし内科の病気と異なり、軟骨・骨の病態の変化を正確に追跡できるマーカーはない。本研究では、炎症増幅因子として注目されている、オステオネクチン、serum amyloid A-3、p39の軟骨疾患にともなう変化を追跡した。本年度は、39k蛋白(p39)をSDS-電気泳動にて分離して、さらにこの蛋白をWestern Blottingにて膜に転写して、そこからp39バンドを切り出してアミノ酸配列を決定した。また39k蛋白のMonoQカラムによる精製も試みた。そのアミノ酸配列の結果は、YKLVXYFTNXSQXRXXPGRであった。コンピュータ検索でこの配列は、牛乳腺の退縮期でミルクに出てくる蛋白の配列と50%一致した。またヒト関節の滑膜細胞の分泌する蛋白とも50%一致した。
またIL-1で誘導される36k蛋白の一部にもこの配列が存在していた。すなわちp39は39および36kの二つの型が存在することが判明した。さらにSDS-PAGEにて分離したp39をマウスに投与して抗体を作成した。この抗体は弱いもののWestern Blotting分析で39kバンドと反応した。まだ免疫染色は行っていない。
IL-1で誘導される11k蛋白のN端のアミノ酸配列は、REWLTFLKEAGQGAKDMXRAでありSerum amyloid A-3の配列と一致した。つまり軟骨細胞がSAA-3を産生することが明らかになった。またPCRにて、IL-1処置によりこのmRNAが誘導されることを見いだした。
軟骨細胞培養系で、p39,オステオネクチンおよびSerum amyloid A-3の合成を及ぼす、TNF-alphaの影響を検討した。TNF-alpha(1000U/ml)はp39およびserum amyloid A-3の合成を著しく促進した。一方、TNF-alphaはオステオネクチン合成を抑制した。ただし、TNF-alphaの作用はIL-1よりも弱かった。またIL-1がp39のmRNAを増加させ、オステオネクチンmRNAを減少させることが判明した。

研究成果

• [文献書誌] Emiko Usui: "Rat Hepatic 3α-Hydoxysteroid Dehydrogenase:Expression of cDNA and Physiological in Bile Acid Biosynthetic Pathway." J.Bichem.115. 230-237 (1994)
• [文献書誌] 中村茂夫: "高分子ヒアルロン酸による細胞基質層からのフィブロネクチンの遊離の抑制-関節軟骨細胞と滑膜細胞培養系を用いたヒアルロン酸の抗炎症作用の解析" 関節外科. 13. 275-281 (1994)
• [文献書誌] Yoshinori Fujita: "Anovel heparin-Dinding protein,H Bp15.is identified as mammalian ribosomal protein L22" Biochem.Biophys.Res.Commun.199. 706-713 (1994)
• [文献書誌] Yoshihiko Ohyama: "Identification of a Vitamin D-respomsive Element in the S'-Flanking Region of the Rat 25-Hydroxyvitamin D_3 24-Hydroxylase Geme" J.Biol.Chem.269. 10545-10550 (1994)
• [文献書誌] Masahiro Iwamoto: "Changes in Parathyroid Hormone Receptors during Chordrocyte Cytodifferentiation" J.Biol.Chem.269. 17245-17251 (1994)
• [文献書誌] Kishi.J: "Gelatinases and metalloproteinase inhibitor secreted by murine colonic caronoma cells with differing meta static Potential." Cell Biology International. 18. 165-170 (1994)
• [文献書誌] Nakagawa.T: "Production of matrix metalloproteinases and Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 by human brain tumors." J.Neurosurgery. 81. 69-77 (1994)
• [文献書誌] Abe T.: "Expression of 72kDa type IV collagenase and invasion activity of human glioma cells." Clinical and Experimental Metastasis. 12. 296-304 (1994)
• [文献書誌] Hayakawa T.: "Cell growth-promoting activity of tissue inhibitor of metalloproteinases-2(TIMP-2)" J.Cell Science. 107. 2373-2379 (1994)
• [文献書誌] Hayakawa H.: "Collagenase activity and Tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1)content in human whole saliva from clinically healthy and Periodontall" J.Periodontal Research. 29. 305-308 (1994)
• [文献書誌] Fujimoto.N: "A one-step sandwich enzyme immunoa ssay for inactive precursor and complexed forms of human matrix metalloproteinase9 using monoclonal antibodies" Clinica Chimica Acta. 231. 79-88 (1994)
• [文献書誌] Imai K.: "Matrix wetalloproteinase 7(matrilysin)from human rectol caneinoma" J.Biol.Chem.270(in press). (1995)
• [文献書誌] Okada Y.: "Localization of matrix wetalloproteinase 9(92KD galrtinase)typeIV collagenase=gelatinase B in osteoclastc." Lab.Invent.72(in press). (1995)
• [文献書誌] Imai K.: "Susceptihility of tenascin to degradation by matrix metalloproteinases and serine proteinases" FEBS Lett. 352. 216-218 (1994)
• [文献書誌] Sato H.: "A matrix metalloproteinase expressed on the surtace of invarive tumorn cells." Nature. 370. 61-65 (1994)
• [文献書誌] Sakiyama H.: "Immano localization of complement Cls and matrix metalloproteinase 9 (92kDa gelatinase)tyipeIV collagenase)in The primanyossification onter of the human femu." Cell Tissue Res. 277. 239-245 (1994)