| 研究課題/領域番号 |
06557120
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
後藤 順一 東北大学, 薬学部, 教授 (80006337)
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| 研究分担者 |
丹羽 俊文 東北大学, 薬学部, 助手 (90218248)
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| キーワード | 酵素免疫測定法 / エレエレクトロスプレーイオン化 / LC / MS / 11-デオキシコルチゾール / キャピラリー電気泳動 / モノクローナル抗体 |
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| 研究概要 |
今日、質量分析法(MS)の進歩、発展は目覚ましく、各種イオン化法を駆使することにより、精度よく分子量数百kDa蛋白が測定できるばかりか、アミノ酸配列をも決定することが可能となりつつある。しかし、蛋白-生理活性分子複合体の構造解析には、高度な生物有機化学的手法を必要とし、MSを合理的に取り入れた構造解析法は、見るべき成果に乏しい。そこで、ステロイドホルモンのモノクローナル抗体を取り上げ、各種イオン化法を用いたMSによる抗原結合ドメインの高次構造解析法の構築を目的とし、本年度は、以下の検討を行った。
まず、副腎皮質ホルモン11-デオキシコルチゾール(11-DOC)を取り上げ、ステロイド核A、C、D環上の特徴的構造を強く認識する抗体を得るべく、感作抗原として4位にブリッジを持つ牛血清アルブミン複合体を調製した。引き続き、これをBALB/cマウスに免疫した後、脾細胞を摘出し、これをミエローマ細胞と融合させ、さらにハイブリドーマの選択とクローニングによりモノクローナル抗体を得た。現在、本抗体をパパインで切断し、得られたFabフラグメントをイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、エレクトロスプレーイオン化(ESI)-MSにて分子量の測定に検討を加えている。一方、ステロイドの酵素免疫測定法では、ハプテンと酵素との結合比を制御することが高感度なアッセイ系を確立する上で、重要となる。そこで、モデル酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを取り上げ、11-DOC-酵素複合体を調製し、移動相に50%メタノールを用い、フローインジェクションモードでESI-マススペクトルを測定した。その結果、塩基性アミノ酸の数に応じた多価イオンが観測され、ハプテンは、反応させたモル比に対応して酵素のリジン残基に結合していることが判明した。今後、本法とキャピラリー電気泳動法とを組み合わせ、ハプテン結合部位の立体構造を解析する予定である。
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