ヒトにおける薬物代謝を予測する新規代替試験法の開発

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06557124
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 鎌滝 哲也 北海道大学, 薬学部, 教授 (00009177)
• 研究分担者: 佐久間 勉 北海道大学, 薬学部, 助手 (30250468) ; 横井 毅 北海道大学, 薬学部, 助教授 (70135226)
• キーワード: 代替法 / 薬物代謝酵素 / チトクロームP450 / 大量発現系 / N-アセチルトランスフェラーゼ / バキュロウイルス発現系 / トランスジェニックマウス / in vitro 毒性試験

研究概要

1.ヒトの薬物代謝酵素の大量調製
ヒトにおける主要な薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)を大量に発現させ、調製する系について検討した。ヒトCYP1A2、CYP2E1およびヒトの胎児に特異的に存在するCYP3A7各分子種のcDNAをそれぞれ組み込んだ組み換えバキュロウイルスを作製し、昆虫細胞株Sf9細胞、Bm6細胞およびカイコ幼虫に感染させ、培養細胞およびカイコ個体両方でP450蛋白質の発現に成功した。また、ヒトCYP2C9およびCYP2D6の酵母での発現にも成功した。CO差スペクトル解析およびイムノブロット分析の結果より、それぞれ目的のP450蛋白質が発現していることを確認した。現在、発現させたそれぞれの蛋白質の酵素活性について検討中である。
2.ヒトの薬物代謝酵素を発現する培養細胞系の樹立
チャイニーズハムスター由来CHL細胞にNADPHチトクロームP450還元酵素(fP_T)とヒトCYP1A2またはCYP2E1のcDNAを導入し、安定的に発現する細胞株を樹立した。また、ヒトの2種類のN-アセチルトランスフェラーゼ(NAT)、NAT1およびNAT2cDNAを導入し、fP_TとNAT1またはNAT2を安定的に発現する細胞株、更に、fP_T、CYP1A2とNAT1またはNAT2を安定的に発現する細胞株を樹立した。
3.トランスジェニック(Tg)マウスを用いた研究
CYP3A7cDNAを導入したTgマウスを作出し、CYP3A7の発現を検討した。その結果、肝臓で発現しているものを初めとして、各組織での発現のパターンが異なる7系統を確認した。この内の1系統のTgマウスと野生型マウスについて各臓器の重量を比較した結果、Tgマウスにおいて腎臓、肝臓(雄性のみ)および子宮は野生型より有意に重く、一方、精巣は軽量であった。現在、Tgマウスの催奇形性物質のスクリーニングへの応用について検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Y.Yanagawa et al.: "Stable expression of human CYP1A2 and N-acetyl-transferase:Mutagenic activation of 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline(IQ)and 2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline(MeIQx)." Cancer Res.54. 3422-3427 (1994)
• [文献書誌] H.Hashimoto et al.: "Fetus-specific CYP3A7 and adult-specific CYP3A4 expressed in Chinese hamster CHL cells have similar capacity to activate carciogenic mycotoxins." Cancer Res.55. 787-791 (1994)
• [文献書誌] S.Ohgiya et al.: "Mouse NADPH-cytochrome P-450 oxidoreductase:molecular claning and functional expression in yeast." Biochim.Biophys.Acta. 1186. 137-141 (1994)
• [文献書誌] T.kato et al.: "Possible occurrence of P450 related to P450 HFLb in extrahepatic tissues of human fetuses and its contribution to metabolic activation of promutagens." Mut.Res.310. 73-77 (1994)
• [文献書誌] T.Yanagimoto et al.: "Molecular cloning and functional expression of a mouse cytochrome P450(Cyp3a-13):Examination of Cyp3a-13 enzyme to activate aflatoxin B_1(AFB_1)." Biohim.Biophys.Acta. 1201. 405-410 (1994)
• [文献書誌] S.Itoh et al.: "A novel form of mouse cytochrome P4503A(Cyp3a-16):Its cDNA cloning and expression in fetal liver." Eur.j.Biochem.226. 877-882 (1994)
• [文献書誌] T.kamataki et al.: "Characters of nouse musk shrew (Suncus Murinus):Focusin on enzymes involved in drug metabolism.in“Proc.of ROC-Japan Symposium on Suncus Murinus:New Experimental animal,its speciality and Usefulness"" Ed.by Chau-Yang Chen Chia Nan Junior College of pharmacy Press, (1994)