| 研究課題/領域番号 |
06557142
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
応用薬理学・医療系薬学
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
安岡 劭 徳島大学, 医療技術短期大学部, 教授 (30035414)
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| 研究分担者 |
山岡 一良 帝人, 第二創薬研究所, 研究員
益田 賢一 帝人, 第二創薬研究所, 主任研究員
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1996
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| キーワード | トリプシン様酵素 / 気道 / 痰 / 慢性気道疾患 / cDNA(遺伝子)のクローニング / 組換え酵素 |
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| 研究概要 |
1.ヒト気道トリプシン様酵素(HAT)の生化学的性質:ヒト粘液性痰からHATを単一にまで精製できた。HATは分子量約27kDaの単量体、基質特異性、プロテアーゼ阻害物質に対する態度からトリプシン型酵素であることが判明した。そのN末端の20アミノ酸残基配列は既知のいずれのタンパクのそれとも一致せず、新しいトリプシン様プロテアーゼであることが明らかになった。
2.HAT遺伝子(cDNA)構造:HATの細胞工学的手法でヒト気管DNAからHATのcDNAのcloningに成功し、その全塩基配列を明らかにした。このcDNAの塩基配列からHATの一次構造を推定した。その結果、HATには418アミノ酸残基からなる前駆体が存在し、これが活性化され成熟HATになると推定された。
3.組み換えHATの生合成:2.の研究に基づき得られた前駆体HAT遺伝子(全長cDNA)をバキュロウイルス/昆虫細胞での発現系の構築を試みた結果、昆虫細胞内に活性型HATの発現が見られた。
4.呼吸器系におけるHATの局在:Native HATに対する抗体を用いた免疫組織化学的研究で、HATは気道粘膜下の漿液腺細胞や粘膜下分泌腺の導管内の上皮細胞から気道粘膜面に分泌されると推定された。
5.HATの活性化機構:ヒト気管抽出液に前駆体HATが含まれていることが判明した。この前駆体はautocatalyticな機序で限定分解され、活性型(成熟HAT)に転換されることを示唆する成績が得られた。
6.HATの生物作用:インフルエンザウイルスはその表面タンパクであるヘマグチニン(HA)がトリプシン型のプロテアーゼの作用によりHA_1とHA_2に開裂することにより活性化され、感染性を獲得する。トリプシンを対照としてHATに本ウイルス活性化作用があるか否かを検索した。しかし、HATは単独ではHA分解作用を示さず、invitroで本ウイルスの活性化作用を示さなかった。この問題は、HATの活性化機構をさらに解明し、再検討する必要があると考えている。HATの気道上皮細胞に対する増殖促進作用や障害作用、本細胞からの生理活性物質放出促進作用、を検討中である。HATが本細胞からサイトカインの放出を促進する成績を得ている。
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