| 研究概要 |
タンパク質分解酵素(エンドペプチダーゼ)の基質特異性を系統的かつ網羅的に検索する簡便な方法を開発する目的で、樹脂結合ペプチドライブラリー^*を基質として用いる新方法を考案し、その諸条件と有用性を検討した。(^*特定の1箇所のみランダムなアミノ酸残基からなるペプチド混合物)
1.ペプチド固定化用樹脂を検討し、アミノメチル樹脂が最適であることが判明した。
2.アミノメチル樹脂結合ペプチドの酵素による切断効率を検討し、ペプチドと樹脂の間に適当なスペーサーを挿入することにより、切断効率が少くとも30倍程度上昇させうることを明らかにし、当面ペンタグリシンをスペーサーとして用いることが適切であるとの結果を得た。
3.Fmoc法による樹脂結合ペプチドライブラリーの合成において、各種ペプチドの合成収率の均一化条件を検討した。この結果、反応速度の遅いFmocアミノ酸を相対的に増量して用いることにより、各ペプチドの合成量比をほゞ3倍以内におさめることが可能となった。
4.本方法をα-キモトリプシンのサブサイト特異性検索に適用し、その有用性を示した。すなわち、モデルペプチドライブラリーとして、RPXF・SPR(G)_5-樹脂,Ac-RPGFXPR(G)_5-樹脂,AcRPGFSXR(G)_5-樹脂(Xはアミノ酸混合物)を合成し、α-キモトリプシンにより加水分解し、分解産物をエドマン分解法により定量分析した。この結果、P_2,P_1′,P_2′サブサイトに関する特異性に関して、興味ある新知見を得た。
5.上記研究と関連して、特異性未知の数種の新規エンドペプチダーゼ^*を生体組織中より精製,性状解明し、予備的な特異性検索を進めた。(^*ブタ小腸粘膜ミクロソーム膜画分由来膜結合性セリンプロテアーゼ,ブタ胃粘膜由来膜結合性VIP特異的セリンプロテアーゼおよび細胞内膜結合トリプシン,ブタ卵巣セリンプロテアーゼFollipsin,クロコウシンカビ非ペプシン型酸性プロテアーゼA)。
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