| 研究課題/領域番号 |
06558107
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
芳賀 達也 東京大学, 医学部(医), 教授 (30011646)
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| 研究分担者 |
横山 茂之 東京大学, 理学系研究科, 教授 (00159229)
豊島 近 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (70172210)
藤原 忠美 株式会社ツムラ, 企画開発本部, 課長
佐々木 博美 株式会社ツムラ, 企画開発本部, 部長
亀山 仁彦 東京大学, 医学部(医), 助手 (50224697)
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| キーワード | 受容体 / 高次構造 / レセプター / 神経伝達物質 / 伝達物質 / Gタンパク質 / アセチルコリン / ムスカリン |
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| 研究概要 |
本年度はムスカリン性アセチルコリン受容体の大量発現系を構築することを主眼として研究した。ムスカリン受容体m2サブタイプのバキュロウイルス発現系における発現効率の向上、構造多様性の排除を目的に、各種変異体を作製した。【.encircleda.】効率的な精製のためN末端に抗体エピトープを融合したもの、【.encircledb.】分子種多様性をのぞくため糖鎖付加部位のアスパラギン残基をアスパラギン酸に変えたもの、【.encircledc.】発現量改善のためポリヘドリンN末11残基を融合したもの、【.encircledd.】翻訳時のN末端小胞体膜透過を促進するためシグナルペプチドを付加したもの、【.encirclede.】第三細胞内ループの中央部分は脱感作に関わる部位でこれを除いてもG蛋白質の活性化能はは失われないのでN末側の変異体のそれぞれにつき、第三細胞内ループ中央部分を除いたもの、などである。これらはいずれも野生型と同じリガンド結合能を示した。また、第三細胞内ループ中央部分を欠損させた変異種は、野生種と同様、Gタンパク質Gi、Goを活性化した。糖鎖を除去した変異体の発現量は、野生型と変わらず、第三細胞内ループを除くことにより発現量が1.5-2倍になった。ポリヘドリンN末を融合したものは逆に発現量が約1/2に減少した。
ムスカリン受容体の構造解析に用いることのできる界面活性剤の検索を行った。ムスカリン受容体m2サブタイプ糖鎖除去変異体を発現させたSf9膜を用いて、各種界面活性剤のムスカリン受容体に対する作用を検討した。リガンド非存在下で受容体を安定に可溶化できるのはジギトニンのみであったが、親和性の高いリガンドQNBを結合した受容体はコール酸系統、アルキルグルコシド系統の界面活性剤の多く、また長鎖長のポリオキシエチレン系界面活性剤によりリガンド結合状態を保ったまま可溶化された。
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