レーザー光ピンセットによる超微細マニピュレータ技術の開発:膜蛋白分子の捕捉と操作

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06558108
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 片山 芳文 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (20014144)
• 研究分担者: 古川 哲史 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (80251552) ; 辰巳 仁史 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (20171720) ; 平井 恵二 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教授 (70156628)
• キーワード: 微分干渉顕微鏡 / ビデオ画像処理 / ナノメートル計測 / 光ピンセット / レーザー光 / 光学技術 / 神経生理学 / 金コロイド粒子

研究概要

1.本研究は、3つの先端的光学技術(ビデオ強化型高倍率微分干渉顕微鏡法、ナノメートル計測法、および光ピンセット法)を総合して新しいシステムを創り出す技術開発研究で、その成果を神経科学の分野に応用して細胞生理学的研究の推進を計ることを目的とする。これらの3つの技術は既に個々独立して使用されているものであるが、今回これらを集約・組織化して生きた細胞あるいは細胞内小器官に操作を加えながらその構造の変化や機能を観察・解析できるようにする。
2.倒立型落射蛍光顕微鏡(ニコン、TMD-300)に高開口数の水浸対物レンズを装着して得た高倍率微分干渉顕微鏡像をビデオ画像強調して最終映像倍率が約10、000倍になるビデオ強化型微分干渉顕微鏡システムを完成し、実際に電気生理学実験に使用することができた。すなわち、本装置を用いて、ラット前脳部ブローカの対角帯核から分離・培養したニューロンの神経突起先端部の成長円錐を観察して実験を行い、成長円錐から神経伝達物質であるアセチルコリンが放出されることを確認した。
3.光ピンセットに用いるレーザー光ビームの照射部位をコントロールするシステムを製作した。光ピンセットとして操作の迅速性と容易性並びに機能の安定性を確保するために、照射部位を大きく移動させる系(粗動操作用)と微小距離移動用の系(微動操作用)からなる機構を採用することにした。粗動操作系として照射部位を大きく動かすためにビームコントローラーで直接レーザー光の照射領域を制御する方式を採用し、粗動操作の機構を組立てて調整に入った段階である。
4.金コロイド粒子を含む液で培養神経細胞を灌流すると、成長円錐に金コロイド粒子が付着している様子をビデオ強化型微分干渉顕微鏡で観察できた。この顕微鏡システムにレーザ光ピンセットを組み込んで光ピンセットで神経細胞の小片やフィロポデイアの先端部、さらに金コロイド粒子などを捕捉し、その位置を移動および固定できることを確認した。しかし、現有の光ピンセットの光源には10mWのヘリウムネオンレーザー管を用いており、その捕捉力は1pN以下である。したがって、金コロイドなど微粒子の運動を十分に制御するには捕捉力が不足している。

研究成果

• [文献書誌] Tatsumi,H.and Katayama,Y.: "Brief increases in intracellular Ca^<2+> activate K^+ current and non-selective cation current in rat nucleus basalis neurons." Neuroscience. 58. 553-561 (1994)
• [文献書誌] Kamiji,T.Morita,K.and Katayama,Y.: "ATP regulates synaptic transmission by pre and postsynaptic mecharisms inguinea-pig myenteric neurons." Neuroscience. 59. 165-174 (1994)
• [文献書誌] Tatsumi.H.and Katayama,Y.: "Calcium homeostasis in the presence of fura-2 in neurons dissociated from rat nucleus basalis:theoretical and experimental analysis of chelating action of fura-2." Journal of Neuroscience Methods. 53. 209-215 (1994)
• [文献書誌] 辰巳仁史,片山芳文: "光と細胞膜イオンチャネルとの相互作用:近接場現象の新しい応用の可能性" 近接場光学研究グループ第二回研究討論会予稿集. 75-80 (1994)
• [文献書誌] Soeda,H.,Tatsumi,H.and Katayama,Y.: "Release of neuroactive substance(s) from growth cones of neurons." Abstracts for lxth Rinshoken International Conference,“Excitatory Amino Acids,Approaches to Clinical Uses.". 3 (1994)
• [文献書誌] Tatsumi,H.and Katayama,Y.: "Evoked release of acetylcholin from growth cones of rat cholinergic newons." Neuroscience Research Suppl.19. S142 (1994)