置換型DNA複製中間体分子構造の電子顕微鏡による解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06640802
• 研究機関: 上智大学
• 研究代表者: 廣川 秀夫 上智大学, 理工学部, 教授 (30011737)
• 研究分担者: 牧野 修 上智大学, 理工学部, 助教授 (70231587)
• キーワード: DNA複製 / 複製中間体 / プロテイン・プライミング / 置換型DNA合成 / DNA電子顕微鏡 / 枯草菌ファージ

研究概要

直鎖状2本鎖DNAの両5'末端に蛋白質を結合しているDNA・蛋白質複合体ゲノムは枯草菌ファージФ29、M2、Nfおよびアデノウイルス等で明らかにされ、DNA複製開始はプロテイン・プライミング反応によることが知られている。DNA複製開始反応に引き続き親鎖の1本、(5'側)を置換しながら伸長合成が進行する。
生化学的解析から 複製中間体は単一分子長(モノメリック)な2本鎖DNAに1本鎖(置換された)が結合した形態と解釈される構造が大多数をしめることが知られている。
本研究はプロテイン・プライミングDNA複製開始反応後、伸長合成へと移行しつつある全てのDNA分子種を電子顕微鏡像として明らかにすることを目的とした。とくに、置換された1本鎖によるパンハンドル型DNA分子と両末端からの置換型複製をしつつある分子の有無について検討した。
ファージM2、あるいはФ29の感染菌をプロトプラスト化し、不連続密度勾配をもつCsC1溶液に直接重層し超遠心により複製中間体を分画し電子顕微鏡試料とした。
最も多く観察された中間体分子型は、M2、Ф29ともに単一分子長である6μm長をもつほぼ半分が2本鎖、半分が1本鎖で構成されていた。ついで、6μm長の2本鎖DNAに1本鎖がついた型であり、しかも1本鎖の長さと、1本鎖の接着点からいずれかの2本鎖の長さが等しい分子型が観察された。今後、観察例を増やし、より正確な複製中間体の分子型を明らかにしたい。

研究成果

• [文献書誌] Higashitani,A.,.Greenstein,D.,Hirokawa,H. Asano.S.,Horiuchi,K.: "Multiple DNA conformational changes in duced by an initiator protein Precede the niking reaction in a rolling circle replication origin" J.Mol.Biol.237. 388-400 (1994)
• [文献書誌] Takada,Y.,Hirokawa,H.,Yamazaki,K.: "Bending of DNA in solution caused by a protein from Arabidopsis that binds to a TATA element" Biosci.Biotech.Biochem.58. 916-920 (1994)
• [文献書誌] Kishi,T.,Miura,K.,Matsumoto,K.,Hirokawa,H.: "Effects of altered RGD(arg-gly-asp)segnences in the primer protein on the protein primed DNA replication of bacteriophage M2 in vitvo" J.Gen.Appl.Microbiol.40. 197-208 (1994)