| 研究概要 |
イネにおいて再分化機構を明らかにするため,再分化に関わる遺伝子を単離する目的で新たに考案したImmunosubtraction法とRT-PCRによるdifferential screening法をイネの培養系に適用した。
1.Immunosubtraction法
再分化誘導直前のカルスの全タンパク質でウサギを免疫し,得られた抗血清を結合させたアフィニティーカラムを作成した.不定胚あるいは不定芽分化を誘導したカルスの全タンパク質をカラムに数回通し,非吸着タンパク質を再分化特異的タンパク質として回収・濃縮した.濃縮したタンパク質を2次元電気泳動で展開したところ,不定胚分化に特異的なタンパク質,不定芽分化に特異的なタンパク質,および不定胚と不定芽分化に共通な再分化特異的タンパク質を同定することができた.しかしながら,得られた特異的タンパク質の量は少なく,アミノ酸配列を決定できるほどの量を回収することはできなかった.
2.RT-PCRによるdifferential screening法
不定胚誘導カルス,不定芽誘導カルス,および再分化誘導前の未分化なカルスの3種類のカルスからそれぞれcDNAを調整し,RAPDプライマーを用いたRT-PCRを行い,PCR産物によるdifferential screeningを行った.cDNAをtotal RNAから合成する場合とpoly(A)^+‐RNAから合成する場合とを比較したところ,total RNAを用いると,マイナ-なバンドが消失することがわかった.発現量の少ない遺伝子をクローニングするため,poly(A)^+‐RNAを用いることにし,特異的PCR断片をクローニングしてノーザン解析を行った.その結果,PCR産物の解析結果とノーザンの解析結果はほぼ一致することがわかった.これまでに8個の再分化特異的クローンを得た.
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