FISHによるMHC遺伝子領域の複製パターンの描出

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06660099
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 奥村 克純 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (30177183)
• キーワード: FISH / MHC / DNA replication / Chromosome structure / GC content

研究概要

本年度は、まず、前年度に行った蛍光in situ hybridization(FISH)法を用いたヒトMHC領域のDNA複製タイミングの追加実験を行うと共に、Fiber FISH法によってDNAセグメント間の複製タイミングを検証した。すなわち、これまでの結果から、細胞種や遺伝子発現の有無によって少し変化するものの、MHC領域のDNA複製はClassIIとClassIIIの間にこの領域内で最も遅く複製する領域が存在し、この領域を境にして少なくとも2つのレプリコンクラスターを形成していると推定された。また、ブロモデオキシウリジン(BrdU)を取り込ませた細胞からExtended Chromatin Fiber(ECF)を調製し、マルチカラーFISHを行ったところ、早く複製するDNAセグメントはBrdUが検出されるFiber上に多く検出される一方、ClassIIとClassIIIの境界付近のDNAクローンはBrdUの検出されないFiber上に検出されることから、FISHによって決定したこの領域の複製タイミング過程を検証できた。さらに、立体構造を保持した細胞核についてこの領域が少なくとも2つのレプリコンクラスターから形成されることを示すための実験を進めている。
一方、画像解析とFISH法の組み合わせによって、一個の細胞核のS期の中でのステージと複製タイミングの決定法を開発した。すなわち、RNase処理した細胞核標本について調べたいクローンを用いてFISHを行い、propidium iodide(PI)染色を行い、その蛍光イメージを低倍率でCCDカメラを通してデジタル信号に変換しコンピュータに取り込む一方、個々の核のFISHシグナルのパターンを高倍率で調べる。画像解析により、PI染色による蛍光量から個々の核のDNA量を算出し、S期のどの位置にある核かを決定する。一方でDNAのFISHシグナルのパターンから調べたいクローンの複製タイミングを決定できる。これらは、核内ゲノムの動態に関する研究を行う基盤的技術を提供した。さらに、ゲノム解析の基盤である各種遺伝子のマッピング等を行った。

研究成果

• [文献書誌] Katsuzumi Okumura: "The Genes for the α‐Type HC3(PSMA2) and β‐Type HC5(PSMB1) Subunits of Human Proteasomes Map to Chromosomes 6q27 and 7p12‐p13 by Fluorescence in Situ Hybridization." Genomics. 27. 377-379 (1995)
• [文献書誌] Akiko Shiratori: "Assignment of the 49‐kDa(RPIM1) and 58‐kDa(PRIM2A and PRIM2B) Subunit Genes of the Human DNA Primase to Chromosome Bands 1q44 and 6p11.1‐p12." Gencmics. 28. 350-353 (1995)
• [文献書誌] Kiyoyuki Torigoe: "YAC‐based 1.5 Mb Contig Spanning the Human Multidrug Resistance Gene Region and Delineating the Amplification Unit in Two Human Multidrug Resistant Cell Lines." Genome Research.5. 233-244 (1995)
• [文献書誌] Hitoshi Kusaba: "Functional Expression of Yeast Artificial Chromosome (YAC)‐Human Multidrug Resistance Genes in Mouse Cells." Genome Research. 5. 245-258 (1995)
• [文献書誌] Tatso Fukagawa: "Human Pseudoautosomal Boundary‐Like Sequences (PABLs): Expression and a Model of Formation of Present‐day Pseudoautosomal Boundary of Sex Chromosomes." Human Molecular Genetics. 5. 23-32 (1996)
• [文献書誌] Nobuhisa Mizuki: "Isolation of cDNA and Genomic Clones for a Human Ras‐related GTP‐Binding Protein and Its Chromosomal Localization to the Long Arm of Chromosome 7,7q36." Genomics. (印刷中). (1996)
• [文献書誌] 奥村克純: "FISHによるDNA複製タイミングの解析とゲノム・インプリンティング." 組織培養. 21. 131-134 (1995)