| 研究概要 |
本研究は著者等の発見したペプスタチン非感受性カルボキシルプロテアーゼ(CP)のうち,Pseudomonas sp. No.101 CP(PCP)に的を絞って,本酵素の構造と機能の解析,特に触媒残基の同定を目的とする。本酵素は原核生物由来の最初のCPでありその全一次構造は既報のいずれのCPとも,また,CP以外のタンパク質とも相同性がない。更に,既報のCPに例外なく,保存されている活性中心アミノ酸配列もない極めて特徴の高いCPである。
1.触媒残基の同定(チロスタチンを応用して)
著者の分散したチロスタチン(N-Isovaleryl-Tyr-Leu-Tyrosinal)をモデルとして,6種類の親和標識化合物を合成した。そのうちの1つ,Z-Phe-2,3-epoxypropyl ester が本酵素を拮抗的に阻害することを認めた。この化合物を用いて,PCPの触媒残基の同定を試み,Asn^<125>-Val-Ala-Lys-Val-Ile-Asn-のペプチドを得たが,触媒残基の同定には至らなかった。
2.高発現系の構築(pKKシリーズのベクターを使用して)
本酵素はアミノ酸 587残基のプレプロ体として生成され,その後,プロセッシングを受けて,372アミノ酸残基の成熟型CPとして分泌される。この組替え体酵素の高発現系の構築を検討し,培養液1リットル当り,50mg程度の発現量を得ることに成功した。
3.触媒残基の同定(部位特異的改変体を使用して)
1.で触媒残基の候補を絞ることができなかったので未検討。
計画外の成果 として,PCPを始めとするCPがプロテアーゼ活性の他に,エステラーゼ活性も合わせ持つことを発見した。これについては,早急にしかるべき学術雑誌に投稿する。
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