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1。DNA結合能を持つ新たなセントロメア蛋白質をコードする遺伝子の同定
昨年度までに、ヒトセントロメア蛋白質B(CENP-B)、及びセントロメア蛋白質C(CENP-C)について、これらがDNA結合能をもつことを明らかにしている。今回、これ以外の新たにDNA結合活性を持つセントロメア蛋白質を同定するため、ヒトcDNAライブラリーより抗セントロメア血清に反応するクローンをスクリーニングし、この中からCENP-B、CENP-C両遺伝子ではないものを選択した。その結果、3つの独立したクローンが得られた。これらの塩基配列を決定したところ、二つは未知の蛋白質の異なる長さの領域を、もう一つはショウジョウバエで同定されているヘテロクロマチン蛋白質(HP1)のホモログをコードしていた。哺乳動物のHP1は最近になって、セントロメア領域近傍に存在することが明らかにされている。そこで、HP1遺伝子を大腸菌に発現させ、ゲル移動度シフト法、サウスウェスタンブロット法によりDNA結合能を解析したところ、ヒトHP1もDNA結合活性を持つことが明らかとなった。
2。オリゴDNAを用いたヒトCENP-Bが結合する最小塩基配列の決定
ヒトCENP-Bはセントロメア領域のサテライト(アルホイド)に存在する幾つかの配列に結合することが知られているが、その結合配列の詳細は不明であった。そこで、標的配列と思われる塩基を2塩基ずつ置換したオリゴヌクレオチドを作成し、組換え体CENP-Bを用いたDNAアフィニティー沈降法により個々の配列のCENP-B結合性を検討した結果、ヒトCENP-Bの結合配列にはかなりの多様性があることが判明した。
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