高速走査型レーザー顕微鏡を用いたカルシウムウェーブの分子メカニズムの研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06670131
• 研究機関: 国立衛生試験所
• 研究代表者: 川西 徹 国立衛生試験所, 病理部, 室長 (40124383)
• 研究分担者: 高橋 道人 国立衛生試験所, 病理部, 部長 (30080005) ; 豊田 和弘 国立衛生試験所, 病理部, 研究員 ; 畝山 智香子 国立衛生試験所, 病理部, 研究員 (30206817)
• キーワード: レーザー顕微鏡 / カルシウムイオン / 蛍光プローブ / カルシウムウェーブ

研究概要

1.初代培養ラット肝細胞にカルシウムイオン蛍光プローブindo-1を取り込ませ、高速走査型共焦点レーザー走査顕微鏡によりカルシウムウェーブ現象を高分解に画像化した。フェニレフリン、バソプレシン、ATP刺激、さらにイノシトール三燐酸の生成機構の異なる肝細胞増殖因子(HGF)刺激によって生じるウェーブについて比較した所、ウェーブの形はHGF刺激に至るまで、同一細胞では同じであった。一方速度論的に解析してみると、ウェーブの開始点における遊離カルシウムイオン濃度は刺激後しばらくしてゆっくりと上昇をはじめ、一定の閾濃度を境に急激に上昇することがわかった。この急激な上昇が始まるまでの時間(これは細胞の刺激物質に対する反応性の指標と考えれるが)は同一細胞でも刺激物質が異なると大きく異なった。また急激な上昇が始まるまでの時間の長い場合は閾濃度が高く、さらにウェーブの伝播速度も低い傾向にあり、イノシトール三燐酸の生成量が少ないことが示唆された。
2.初代培養ラット肝細胞の細胞骨格、ミトコンドリアをそれぞれ抗チュブリン抗体およびロダミン123で染色してホルモン性刺激によって生じるカルシウムウェーブの形と比較したが、関係は見いだせなかった。またコルヒチン処理によって微小管を破壊した細胞においてもカルシウムウェーブは生じた。
3.初代培養肝細胞へ各種蛍光プローブのアセトキシメチル体を長時間インキュベートすることによりカルシウムイオン貯蔵部位にプローブを取り込ませ、貯蔵部位におけるカルシウムイオン濃度の測定を試みた。Fura-2の場合についてイノシトール三燐酸添加による蛍光強度比変化が明瞭に観察され、さらにこの変化はヘパリンによって抑制されること等から、貯蔵の画像化が可能であることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Toru KAWANISHI,Megumi KAWANISHI,Hisayuki OHATA,Kazuhiro TOYODA,Michihito TAKAHASHI,Kazutaka MOMOSE and Yuzo HAYASHI: "The relationship between Spontaneous Calcium Oscillations and Cell Proliferation in Cultured Smooth Muscle Cells." Jpn.J.Pharmacol.65. 59-62 (1994)
• [文献書誌] Toru KAWANISHI,Hiroki ASOU,Takashi KATO,Chikako UNEYAMA,Kazuhiro TOYODA,Hisayuki OHATA,Kazutaka MOMOSE and Michihito TAKAHASHI: "Ratio-imaging of Calcium Waves in Culture Hepatocytes Using Rapid Scannning Confocal Microscope and Indo-1.21GC02:Bioimages" 2. 7-14 (1994)
• [文献書誌] 川西,徹: "細胞内カルシウムの動的観測" O plus E. 180. 83-90 (1994)
• [文献書誌] Takashi KATO,Kazuhiro TOYODA,Hisayuki OHATA,Kazutaka MOMOSE,Michihito TAKAHASHI and Toru KAWANISHI: "Kinetic Profiles of calcium waves in primary cultured hepatocytes revealed by rapid scanning confocal microscopy." Jpn.J.Pharmacol.67. 19P (1995)
• [文献書誌] Hikaru TANAKA,Yoshimitsu KATO,Ryu NAKAMURA,Toru KAWANISHI and Koki SHIGENOBU: "Insulation of nuclear Ca^<2+> movements from those of the cytoplasm in cardiac myocytes as revealed by rapid scanning confocal microscopy." Jpn.J.Pharmacol.,. 67. 52P (1995)