| 研究課題/領域番号 |
06670175
|
|---|
| 研究機関 | 久留米大学 |
|---|
研究代表者 |
山田 亮 久留米大学, 医学部, 講師 (50158177)
|
|---|
| 研究分担者 |
七条 茂樹 久留米大学, 医学部, 助教授 (30080592)
星野 友昭 久留米大学, 医学部, 助手 (00261066)
|
|---|
| キーワード | LFA-1様抗原 / 接着分子 / 悪性腫瘍 / 外分泌腺 |
|---|
| 研究概要 |
発現ベクターを用いてLFA-1様抗原遺伝子のクローニングを試みた。すなわち、MKN45. 16細胞より発現ベクターpME18Sを用いてcDNAライブラリーを作製し、DEAE-デキストラン法によりCOS-7細胞に発現させた。形質転換後、抗LFA-1抗体によりLFA-1様抗原陽性細胞を検出、選別した。プラスミドDNAを回収し、大腸菌内で増幅した後、再度COS-7細胞で発現させた。この操作を4回繰り返しLFA-1様抗原遺伝子の濃縮・単離を行ない、最終的に2個のcDNAクローンが得られた。これらについて塩基配列の決定を行なったところ、1個のクローンはprosaposin遺伝子の3'非コード領域に高い相同性があった。いずれのクローンも終始コドンにより分断されており、LFA-1様抗原をコードしえないことが示唆された。また、本法ではバックグランドが高いためクローンの濃縮効率が悪く、LFA-1様抗原遺伝子のクローニングには適さない事も判明した。そこで、タンパクの解析にもとずくクローニング法に着手した。MKN45. 16より抗LFA-1抗体で免疫沈降を行ないさらに2次限電気泳動を行なうことによりLFA-1様抗原を単離することに成功した。2次限電気泳動により得られたLFA-1様抗原のN-末端アミノ酸配列の決定をペプチド自動シークエンサーにより行なったが、分子量が大きすぎるため決定することはできなかった。そこでトリプシン分解ペプチドのアミノ酸配列決定を質量分析計を用いて現在行なっているところである。クローニングと並行して、単離されたLFA-1様抗原分子の生化学的性状も明らかにした。
|
