コレラ菌エルトール溶血毒素の産生を制御する遺伝子の機能解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06670291
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 山本 耕一郎 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (30158274)
• 研究分担者: 飯田 哲也 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (90221746) ; 本田 武司 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (60029808)
• キーワード: コレラ菌 / 溶血毒 / 塩基配列 / 腸管毒 / フォスフォリパーゼ / トランスポゾン / 遺伝子 / 蛋白質

研究概要

(1)エルトール型コレラ菌の溶血毒非産生性変異株の一つNF404株でのTn5の挿入部位は構造遺伝子(hlyA)やその周辺領域ではないことが確認された。Tn5挿入領域をクローン化し、その領域をプローブとして、親株N86の遺伝子ライブラリーから対応する領域をクローン化した。(2)クローン化した領域を約2kbにわたり塩基配列の決定を決定した。その結果NF404でのTn5挿入部位にopen reading frame(ORF)を見い出し、これをlypAと命名した。このORFがコードするタンパクは大腸菌のlysophospholipase L2(PLDB)と全領域に渡り高い相同性を示した。また、lypAの下流には別のORFがみいだされ、このORFは大腸菌でPLDBの遺伝子(pldB)の下流に存在するORF0171と高い相同性を示した。(3)またクローン化したlypAは大腸菌のPLDB活性を著しく上昇させた。また、NF404では親株N86に比較してPLDB活性が著しく低下していたが、これはクローン化したlypAによって回復した。これらのことからlypAはコレラ菌のlysophospholipase L2の構造遺伝子であることが示唆された。(4)しかし、in transでNF404株に導入されたlypAは溶血性を復活させなかった。一方、また、hlyA上流の狭いプロモーター領域のみでNF404株の溶血性が回復することを見い出した。また、lypAの内部を含むプラスミドをN86株に導入によるsingle cross-overによってlypAをノックアウトした株ではPLDB活性は著しく低下したが、溶血活性には影響を与えなかった。
以上の結果から溶血性に関与する遺伝子はlypAの周辺に存在するものと考えられる。現在、lypA周囲に存在すると考えられる溶血性を制御する遺伝子を検索中である。この事hlyAの発現制御にはリプレッサーが関与する事を示唆している。したがって、hlyAのリプレッサー遺伝子を明らかにする試みをしている。

研究成果

• [文献書誌] Xu,M.,Iida,Yamamoto,K.,and Honda,T.: "Demonstration and characterization of simultaneous production of a thermostable direct hemolysin isolated from Vibrio parahaemolyticus strain,TH3766." Infect.Immun.62. 166-171 (1994)
• [文献書誌] Miyagi,K.,Matsumoto,Y.,Hayashi,K.,Yoh,M.,Yamamoto,K et al.: "Sucessful application of enzyme-labeled oligonucleotide probe for rapod and accurate cholera diagnosis in a clinical laboratory." Microbiol.Immunol.38. 301-304 (1994)
• [文献書誌] Shimaoka,M.,Yoh,M.,Segawa,A.,Tarakara,Y.,Yamamoto,K.,et al: "Development of enzyme-labeled oligonucleotide probe for mecA gne in methicillin-resistant Staphylococcus aureus." J.Clin.Microbiol.32. 1866-1869 (1994)
• [文献書誌] Xu,M.,Yamamoto,K.,and Honda,T.: "Construction and charcterization of an isogenic mutant of Vibrio parahaemolyticus having a deletion in the thermostable direct hemolysin-related hamolysin gene(trh)." J.Bacteriol.176. 4757-4760 (1994)
• [文献書誌] Tang,G.,Iida,T.,Yamamoto,K.and Honda,T.: "A mutant toxin of Vibrio parahaemolyticus thermostable direct hemolysin which has lost hemolytic activity but retains ability to bind to erythrocytes." Infect.Immun.62. 3299-3304 (1994)
• [文献書誌] Taniguchi,T.,Arita,M.,Sato,M.,Yamamoto,K.,Miwatani,T.Honda,T.: "Evidence that the N-terminal amino acid sequence of pilus colonization factor antigen III produced by human enterotoxigenic Escherichia coli is similar to that of TcpA pillin of Vibrio cholerae." J.Infect.Dis.170. 1049-1050 (1994)