| 研究課題/領域番号 |
06670367
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| 研究機関 | (財)東京都神経科学総合研究所 |
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研究代表者 |
荻本 真美 (財)東京都神経科学総合研究所, 微生物学・免疫学研究部門, 主事研究員 (80158609)
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| 研究分担者 |
矢倉 英隆 (財)東京都神経科学総合研究所, 微生物学・免疫学研究部門, 副参事研究員 (60166486)
片桐 達雄 (財)東京都神経科学総合研究所, 微生物学・免疫学研究部門, 主事研究員 (00233742)
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| キーワード | CD45 / レセプター型チロシンフォスファターゼ / リガンド / バキュロウィルスベクター |
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| 研究概要 |
RABC型および、RO型のCD45のリガンドを同定することを目的とし、本年度は、RABC型および、RO型のCD45細胞外領域を含むコンストラクトを作成し、Sf9細胞へのトランスフェクションを行った。具体的には、まず、バキュロウイルスベクターpBlueBacHis CにCD45の細胞外領域をコードするcDNAを組み込んだ。効率よい発現を行うために、5'側から約130bpのCD45cDNAの非翻訳領域を除いたコンストラクトを作成する必要があり、このために、翻訳領域の5'側600bpをPCR法により増幅し、その下流の部分と繋いだ約1.2kbの断片をベクターに組み込みコンストラクトを作成した。現在、これをバクテリアにトランスフォームすることにより大量に得たDNAを精製し、Sf9細胞へのトランスフェクションを行っているところである。まだ、発現蛋白の確認まではいっていないが、糖鎖修飾が比較的正確な形で行われているバキュロウイルス/Sf9細胞の系を用いているため、細胞外領域に糖鎖が多いCD45蛋白の発現もネイティブに近い形で行われることが期待できる。
平成7年度は、現在発現を行っているCD45蛋白を精製し、リガンドの同定を試みる予定である。具体的には、精製CD45をビオチンで標識し、CD45が結合する細胞をアビジン-FITCを用いたFACS解析で検索する。CD45結合細胞が見つかった場合、その細胞表面に発現する既知の分子に対する抗体の中から結合を阻害するものを選び出す。もし、既知の抗体の中に阻害抗体がない場合は、CD45の結合する細胞を免疫原にしてモノクローナル抗体を作成し、CD45の結合を阻害するクローンを選び出す。その抗体を用いて、リガンド蛋白の性状を明らかにする。
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