| 研究課題/領域番号 |
06670584
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
消化器内科学
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
加川 建弘 東海大学, 医学部・第三内科, 講師 (30245469)
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| 研究分担者 |
中野 敦史 東海大学, 医学部・第三内科, 助手 (20246094)
渡辺 勲史 東海大学, 医学部・第三内科, 助教授 (90167156)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1995
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| キーワード | コラーゲン / 肝硬変症 / イト-細胞 / リボザイム |
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| 研究概要 |
1.Ito cellの単離:潅流法、パーコール比重遠沈法にて高純度に(90%以上)Ito cellを単離することが可能であった。またその技術にも習熟し安定したIto cellの分離が可能となった。
2.標的RNAの作成:1600bpのラットtype I collagen α(I) cDNAの塩基配列をdye primer法にて決定した。〔α^<32>P〕UTPを用いたin vitro transcription法にて標的RNAを作成した。
3.リボザイムの作製:コンピュータープログラムをもちいてリボザイムの標的部位を決定し、標的に対するハンマーヘッド型リボザイムをデザインした。T7promoter配列を含むtemplate DNAからin vitro transcription法にてリボザイムRNAを合成した。
4.リボザイム切断効果の検討:^<32>P標識した標的RNAにリボザイムを添加し、37℃でincubateし、ゲル電気泳動後、autoradiographyを行い、切断断片を検出した。リボザイムの最大切断活性は約70%であった。また時間依存性、マグネシウムイオン依存性が確認された。
5.分離Ito cellに対する影響:分離Ito cellにリボザイムを各種濃度で添加し、37℃で培養した。1時間毎に12時間後まで細胞を回収、AGPC法にてRNAを抽出した。rat type I collagen a (I)遺伝子のリボザイムの切断部位より下流の配列に相補的なoligo DNAを^<32>P-labelしてプローブとし、northern blottingを行ったが、切断効果はわずかしか得られず、細胞内導入法に課題が残った。
今後の展開:リボザイムによってcollagen mRNAが切断できることが示され、肝硬変症治療の可能性が開かれたが、細胞内導入に当たっては不十分で、ウイルスベクターを用いた導入法を検討中である。
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