|
PCRを用いてcDNAをクローニングする方法は、現在まで幾つか報告されている。われわれも、nested RACE法を用い、種々のcDNAの構造解析を行なってきた。しかし、既報のいずれの方法も、cDNAの長さやRNAの立体構造上の問題などから多くの限界がある。今回われわれは、cDNAライブラリーを鋳型とし、ベクターDNAと目標とする遺伝子の既知部分のプライマーを用い、二段増幅し、簡単に迅速決定する方法を確立した。この方法は、サザンブロット分析なしに、5′と3′両方向にcDNA walkingが可能である。この方法を用いて、ヒト脳の蛋白カルボキシメチル化酵素のcDNA配列を決定した。
また、本酵素は、広く哺乳類に存在し、脳、睾丸と赤血球に酵素活性が高く、ノーザンブロット分析でも本酵素の遺伝子は、脳と睾丸に強く発現している。そこで、in situハイブリダイゼーション法を用いて、PIMT遺伝子発現のラット脳での局在性を分析した。脳と睾丸以外での組織では、反応はほとんど認められなかった。脳では、神経細胞に特異的に反応が認められた。海馬のCA1およびCA3領域の錘体細胞層に主に局在し、大脳皮質では各層に散在していた。しかし、被殻尾状核には反応はほとんど認められなかった。
さらに、我々はPCRのArtifact産物をIntermal Standardとして利用する新しいCompetitive PCRの開発に成功した。この方法を用いて、微量の脳下垂体での本酵素のmRNAを定量した。
|
